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HBeAg通过促肝纤维化的TLR2介导巨噬细胞的炎症功能

摘要

背景

我们和其他人已经证实,巨噬细胞的活化在HBV感染期间的肝损伤和纤维化中起着关键作用。我们也证明了与HBsAg和HBcAg相比,HBeAg能明显诱导巨噬细胞炎性细胞因子的产生。然而,HBeAg在巨噬细胞活化中的受体、功能域及其在肝纤维化中的作用和机制尚不清楚。

方法

通过Co-IP法对HBeAg可能的直接结合受体进行筛选和验证。同时,通过表面可达肽的预测、截短片段的构建和合成,分析HBeAg激活巨噬细胞的功能域和可达肽。此外,通过Transwell、CCK-8、凝胶收缩试验、Phospho Explorer抗体芯片和Luminex试验研究了hbeag处理的巨噬细胞诱导肝星状细胞活化的作用和机制。最后,通过免疫组化、免疫荧光、ELISA和肝酶检测,评估HBeAg在人和小鼠肝脏炎症和纤维化中的作用。

结果

在这里,我们验证了TLR-2是HBeAg的直接结合受体。同时,HBeAg核心结构域c端肽(122- 143aa .)是巨噬细胞激活的关键。尽管HBcAg和HBeAg具有相同的核心结构域,但其富含精氨酸的结构域隐藏了这一功能。此外,HBeAg以巨噬细胞依赖的方式促进肝星状细胞(HSCs)的增殖、运动和收缩,但不是单独的。PI3K-AKT-mTOR和p38 MAPK信号通路负责造血干细胞的运动表型,Smad-dependent TGF-β信号通路负责造血干细胞的增殖和收缩。此外,多种趋化因子和细胞因子,如CCL2、CCL5、CXCL10和TNF-α,可能是HSC激活的关键介质。一致地,HBeAg通过TLR-2诱导小鼠的短暂炎症反应并促进早期纤维形成。最后,临床研究提示HBeAg水平与HBV感染患者的炎症和纤维化程度相关。

结论

HBeAg通过TLR-2/NF-κB信号通路激活巨噬细胞,并在巨噬细胞的帮助下促进HSC的运动、增殖和收缩,从而进一步加剧肝纤维化。

同行评审报告

背景

乙型肝炎是一个全球公共卫生问题,因为感染乙型肝炎病毒(HBV)的患者进展为慢性活动性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)的风险增加[1.,2.].HBV进入肝细胞并开始复制后,可在肝脏和外周血中检测到病毒相关蛋白。hbv相关蛋白主要由乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心相关抗原(HBcrAg)和HBx蛋白组成[3.]HBcrAg由三种由前核心/核心区编码的蛋白质组成,包括乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)在临床实践中,HBsAg被估计为HBV感染或肝内病毒复制活性的替代标志物。一些研究表明,HBsAg在促进持续HBV感染方面起着至关重要的作用,而其他研究表明,HBsAg和HBcAg也可诱导免疫反应,促进肝脏的免疫功能陪审团[3.,4.,5.]HBx蛋白可使肝细胞对致癌因子敏感,并通过解除对细胞凋亡和增殖控制的调控而导致HCC[6.]此外,血清HBeAg水平与病毒复制、传染性、炎症、疾病严重程度和抗病毒治疗反应有关[7.]然而,病毒相关蛋白调节免疫应答的功能及其潜在机制尚未完全阐明。

HBV的持久性、清除和发病机制与天然免疫系统和各种病毒蛋白之间的相互作用密切相关。巨噬细胞作为天然免疫系统的重要组成部分,在检测HBV和调节炎症诱导的肝损伤中起着至关重要的作用hibit病毒复制,但同时也导致肝细胞损伤[8.].另一方面,病毒蛋白破坏巨噬细胞的免疫反应,导致免疫耐受或建立慢性HBV感染[9].我们最近的工作证明,与HBCAG和HBsAg相比,HBEAG是诱导巨噬细胞活化的HBV相关抗原中最重要的因素,通过促进炎性细胞因子生产,HBeAG诱导的miR-155加速肝损伤[10.]然而,巨噬细胞识别HBeAg的受体及其激活的分子机制仍然是个谜。

toll样受体(TLR)家族是最著名的模式识别受体(PRR)家族之一,负责识别来自病原体和受损宿主细胞的各种分子[11.].例如,细菌外膜的主要成分脂蛋白和脂多糖是TLR-2和TLR-4最著名的配体。此外,细胞内的生命编码分子如DNA和RNA分别被TLR-9和TLR-3/7/8识别。近年来,TLR配体的数量仍在增加,涵盖了多种微生物组分。Chang等人发现TLR-2也可能在识别丙型肝炎病毒核心和NS3蛋白中发挥关键作用,从而激活巨噬细胞[12.].此外,肠病毒71病毒样颗粒通过激活TLR-4诱导人单核细胞来源的树突状细胞的活化和成熟[13.]巨噬细胞是否也能通过TLR依赖的信号通路识别HBeAg还有待进一步探讨。

在慢性HBV感染中,持续免疫反应引起的进行性肝细胞损伤,伴随广泛的组织重塑和血管紊乱,最终将导致纤维化和肝硬化[14.]众所周知,活化的肝星状细胞(HSC)仍然是推动其进展的中心效应细胞,其经历表型转分化为高度增殖、收缩、趋化和纤维化的肌成纤维细胞[15.].在肝脏微环境中,来自周围细胞的细胞外信号以旁分泌的方式促进造血干细胞的激活。巨噬细胞是纤维化进程和沉积的细胞外基质(ECM)重塑的主要调节者之一。越来越多的证据表明,活化的巨噬细胞可产生促纤维化介质,如生长因子、细胞因子、趋化因子等,有助于造血干细胞的激活和募集,并进一步加速ECM的沉积。另一方面,活化的造血干细胞也会分泌趋化因子吸引巨噬细胞,导致这一病理过程的放大[16.].我们之前的研究结果已经证实,HBeAg激活的巨噬细胞会增加多种细胞因子的表达和分泌[10.].但目前尚不清楚HBeAg是否能直接激活造血干细胞或通过巨噬细胞依赖的方式促进肝纤维化的发生和进展。

在本研究中,我们发现HBeAg影响巨噬细胞中TLRs的表达,从而调节固有免疫应答。根据TLR-2的高表达,HBeAg作为TLR-2的新配体,通过NF-κ b介导的信号通路诱导生长因子、细胞因子和趋化因子,其c端肽(122- 143aa .)对巨噬细胞的激活至关重要。此外,我们发现HBeAg以巨噬细胞依赖的方式促进造血干细胞的增殖、收缩和运动,为肝纤维化及其相关并发症的进展提供了一种新的机制。与上述结果一致的是,临床资料显示HBeAg水平与HBV感染患者的炎症程度、巨噬细胞浸润程度、纤维化分期有关。

方法

患者

本研究于2017年5月至2018年3月在山东第一医科大学附属山东省医院招募212例患者,其中急性乙型肝炎(AHB)患者61例,慢性乙型肝炎(CHB)患者151例。根据EASL 2017乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南诊断AHB和CHB [17.].本研究的纳入标准为(1)≥18 岁和(2)存在乙肝表面抗原。排除标准为(1)与HCV、HIV或其他慢性肝病合并感染;(2)平均每日摄入> 40 男性和年龄>20岁的女性饮酒量g (3)以前的肝脏手术或肝移植;(4)3年内抗病毒治疗或免疫抑制药物 月。在纳入本研究之前,获得了每位患者/监护人的口头或书面知情同意,本研究得到了山东第一医科大学附属山东省立医院伦理委员会的批准。患者的基本信息汇总在表中1..另外,由熟练的内窥镜专家和超声专家分别检测肝纤维化和肝硬化的并发症[18.].

表1入选受试者的临床特征

动物实验

雄性Balb/c小鼠购自北京维生河实验动物技术有限公司(中国北京),并饲养在特定的无病原体环境中。所有实验均在6到8岁之间的小鼠身上进行 周龄符合山东第一医科大学附属山东省立医院科学调查委员会的规定。为检测HBeAg在体内的作用,向小鼠(每组5只)注射重组HBeAg 40 μg或通过尾静脉接受等量的PBS,然后在4、8、12和24时处死 h分别为。为了研究HBeAg在肝纤维化进展中的作用,小鼠单次腹腔注射橄榄油或CCl4.(1 ml/kg橄榄油)。第2天和第3天,CCl4.-接受治疗的小鼠静脉注射HBeAg 40 μg或相同体积的PBS(N=5只/组)。第4天,处死所有小鼠,采集肝脏和血液并冷冻以供进一步分析。通过腹腔注射200%葡萄糖来实现单核细胞的去除 CCl前μl氯膦酸盐脂质体或对照脂质体4.或e抗原治疗。为验证TLR-2在体内的作用,将C29溶解稀释至适当剂量,在HBeAg处理前1 h,以相同体积的溶解试剂(10% DMSO/40% PEG300/5% Tween-80/45%生理盐水)作为载体组,腹腔注射(1.3 μmol/g)。

细胞培养、试剂和抗体

小鼠巨噬细胞RAW264.7 (ATCC, Rockville, MD, USA)和人星状细胞LX-2 (Procell, Wuhan, China)在含10% (vol/vol) FBS (Gibco®Sera, AUS)的DMEM (Gibco- BRL, Grand Island, NY, USA)中培养。人单核细胞THP-1, U937 (ATCC, Rockville, MD, USA)在RPMI 1640培养基(Gibco;Thermo Fisher Scientific, Inc.)补充10% FBS (Gibco®Sera, AUS)。小鼠原代肝星状细胞和Kupffer细胞的获得和培养基于前面的描述[4.,19.].利用Ficoll-Paque密度梯度离心技术从健康献血者外周血单个核细胞分化出人单核细胞来源的巨噬细胞(hMDM) [12.].所有细胞在37°C、5% CO的培养箱中培养2.

HBeAg (ab91273)和HBcAg (ab119441)购自Abcam公司(Abcam, Cambridge, UK)。C29 (TLR-2抑制剂,HY-100461)、resatorvid (TLR-4抑制剂,HY-11109)、硫酸羟氯喹(TLR-7/9抑制剂,HY-B1370)、CU-CPT9b (TLR-8抑制剂,HY-112051)、SB202190 (p38 MAPK抑制剂,HY-10295)、SP600125 (JNK抑制剂,HY-12041)、PD98059 (ERK1/2抑制剂,HY-12028)、tofacitinib (JAK1/2/3抑制剂,HY-40354)、(E)-SIS3 (Smad3抑制剂,HY-13013)和dactolisib (PI3K/mTOR抑制剂,HY-50673)购自MCE (MedChemExpress,上海浦东新区,中国)。PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate, ab120297)购自Abcam公司(Abcam, Cambridge, UK)。TLR-3 (ab17264)、TLR-2 (ab16894)、TLR-4 (ab30667)阻断抗体购自Abcam公司(Abcam, Cambridge, UK)。GAPDH (60004-1-lg)、β-actin (66009-1-Ig)和TLR-6 (22240-1-AP)的一抗购自Proteintech Group, Inc. (Proteintech, Wuhan, China)。TLR-1的一抗(abs135699)购自Absin Bioscience公司(Absin, Shanghai, China)。P65(#8242)、p-P65(#3033)、GST(#3368、#2624和#2625)、α-SMA(#19245)、Collagen1A1(#91144)、p-FOXO3a(#9466)、p-Smad3(#9520)、p-Smad2(#18338)、mTOR(#2983)、p-JNK(#4668)、p-P38(#4511)、P38(#8690)、p-ERK(#4370)、ERK(#4695)、p-PI3K(#4228)和PI3K(#4257)的一组抗体来源于细胞信号(cell - signaling Technology, cell - signaling Technology, cell - signaling Technology, cell - signaling Technology),美国波士顿)。TLR-2 (ab209217)、F4/80 (ab6640)、纤联蛋白(ab268021)、CD68 (ab213363)、FOXO3a (ab109629)、Smad3 (ab40854)、Smad2 (ab33875)、p-STAT5 (ab32364)、STAT5 (ab32043)、p-STAT3 (ab76315)、STAT3(ab68153)、p-mTOR (ab109268)、JNK (ab179461)、p-AKT1 (ab108266)、AKT1 (ab108202)的一抗购自Abcam公司(Abcam, Cambridge, UK)。 Corresponding HRP-conjugated secondary antibodies were purchased from Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Alexa Fluor® 488 and 594-conjugated secondary antibodies for immunofluorescence were purchased from Abcam (Abcam, Cambridge, UK). Recombinant HBeAg domains (ArD, ΔRP-E, Δ1-17-E, Δ29-96-E, and Δ122-143-E) were obtained from Dia-An Biotech (Dia-An Biotech, Wuhan, China). Clophosome-A clodronate liposomes (Anionic, 7 mg/ml, F70101C-A) and control liposomes (F70101-N) were purchased from FormuMax (Sunnyvale, CA, USA).

RNA干扰

靶向人TLR-2的小干扰(si) RNA (seq-1: 5 ' -TTTGATGACTGTACCCTTAAT-3 ';seq-2: 5“-GGAAGATAATGAACACCAA-3”;seq-1: 5 ' -GGCTTCTCTGTCTTGTGAC-3 '),小鼠TLR-1 (seq-1: 5 ' -CCGTCCCAAGTTAGCCCATTT-3 ');seq-2: 5“-GCCTTCAGGATGTTCAATTAT-3”;seq-1: 5 ' -CATCCTCTCATTGTCCAAGCT-3 '),小鼠TLR-6 (seq-1: 5 ' - caataccaccgttctccatttt -3 ');seq-2: 5“-GGAATGGTTTGAAGAACTT-3”;小鼠TLR-3 (seq-1: 5 ' -GCTGAGCAGTTTGAATATA-3 ');seq-2: 5“-CCACCTACCAACTTTACAA-3”;seq-1:5 ' - gctcatttgaatcagcaa -3 ';seq-2: 5“-ACTTAAGGGCAGCCATTAATA-3”; seq-3: 5′-GATGAAGTCTCTGCAACAATT-3′), human TLR-6 (seq-1:5′-GGTCTTATTCATGTTCCAA-3′; seq-2: 5′-CAAAGAACCTATTGTTAAA-3′; seq-3: 5′-GGTGCTTACAACTGACTAA-3′) sequences, and negative control siRNA were purchased from Genepharma (Pudong new area, Shanghai, China). RNAis were added to cells accompany with the lipofectamine MAX (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) based on the manufacturer’s protocol. After interfering for 48 h, protein knockdown efficiency was analyzed by western blot.

定量实时PCR(QRT-PCR),文库制备和RNA的测序

如前所述,进行总RNA提取,QRT-PCR和RNA酶[10.].qRT-PCR引物序列如表所示2..选择生长因子,细胞因子,趋化因子和TLR的表达谱,并拉出相应的热图。

表2用于定量实时PCR的引物

免疫共沉淀(Co-IP)和westernblot分析

根据制造商的协议,Co-IP使用capture IP & Co-IP Kit (Takara, Kusatsu, Japan)进行。简单地说,每106.用200 μl裂解/平衡缓冲液与蛋白酶抑制剂混合,冰敷30分钟裂解细胞。17000g离心10min后取细胞裂解上清。然后,上清液或混合重组蛋白与GST或TLR-2抗体或同型IgG (Cell signaling Technology, Boston, MA, USA)在4℃下孵育过夜。第2天,用平衡旋转柱离心,用100 μl洗涤液洗涤。洗脱后的蛋白用GST或TLR-2一抗进行western blot分析。重组人TLR-2 (H-TLR-2, 2616-TR)和小鼠TLR-2 (M-TLR-2, 1530-TR)购自R&D Systems公司(Minneapolis, MN, USA)。Western blot检测如前所述[10.].

酶联免疫吸附试验(ELISA)和肝酶测定

根据制造商说明,小鼠IL-6 (KMC0061, Invitrogen,卡尔斯巴德,CA,美国),小鼠TNF-α (KMC3011, Invitrogen,卡尔斯巴德,CA,美国),小鼠IFN-β (439407, BioLegend, Inc.)。采用市售ELISA试剂盒测定细胞培养上清中的人IL-6 (Proteintech,武汉,中国)和人TNF-α (Proteintech,武汉,中国)。血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)浓度测定试剂盒购自南京精建成生化研究所(中国南京)。

组织病理学评估和免疫组化

来自活检或手术的肝脏标本用福尔马林固定,然后嵌入5μm厚的石蜡切片中。在不了解临床数据的情况下,高级肝病学家对所有慢性乙型肝炎患者进行组织病理学评估。采用METAVIR评分系统,通过Masson法区分肝纤维化和炎症活动s三色和苏木精-伊红染色[20.,21.].此外,如前所述检测免疫组化染色[22.]阳性面积率由Image Pro Plus 5.0评估。

免疫荧光

用P65单克隆抗体和GST标记检测NF-κB核转位和HBeAg细胞定位。对于NF-κB核易位,Alexa Fluor®488或594结合的二抗(Abcam, Cambridge, UK)孵育2小时。细胞核用4 ',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, Abcam, Cambridge, UK)染色。肝冷冻切片用大鼠抗小鼠F4/80 (Abcam, Cambridge, UK)和兔抗小鼠-α-SMA (Cell-Signaling Technology, Boston, USA)过夜,再用二抗和DAPI进行α-SMA和F4/80双免疫荧光染色。将Desmin和ki67与原代大鼠抗小鼠ki67 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)和兔抗小鼠-Desmin (cell signaling Technology, Boston, USA)进行肝脏冷冻切片和孵育。使用荧光显微镜(Olympus BX63,东京,日本)或共聚焦荧光显微镜(徕卡TCS SP8)捕捉图像。

条件培养基的制备

从对照和活化巨噬细胞收集的培养基被定义为条件培养基(CM)。U937细胞在PMA(英国剑桥Abcam)存在下以50%的最终浓度培养后 24纳克/毫升 h、 大多数悬浮细胞分化为巨噬细胞并附着于板底。接下来,用PBS清洗粘附细胞两次,并用无血清培养基培养。在整个实验期间,巨噬细胞作为对照或与HBeAg孵育24小时 从对照组(CM-C)和活化的巨噬细胞(CM-E)收集的CM在加入LX-2细胞之前用0.45-mm的膜过滤器过滤。

肝星状细胞迁移试验

通过Transwell测定法测量HSC迁移。大约104.将HSC悬浮在补充有1%FBS的介质中,置于24孔transwell板(孔径8 下腔补充10%FBS和(a)在37℃孵育的无血清培养基 °C,在含5%CO的培养箱中2.(b) HBeAg无血清培养基(2 μg/ml), (c) CM- c, (d) CM- e。Transwell板在培养箱中保存24小时,并根据过滤器下表面随机选取的5个区域的平均值估计细胞迁移。

细胞增殖试验

通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定肝星状细胞的相对增殖率(Vazyme,中国南京).将HSC以2000个细胞/孔的速度接种在96孔培养板中,并培养过夜。用HSC迁移试验中提到的培养基替换标准细胞培养基后,再培养24小时 h、 移除培养基后,将CCK-8溶液(以1:9的比例用无FBS的高糖DMEM稀释)添加到每个培养孔中并培养1小时 h、 在450℃测定光密度(OD) 使用微孔板读取器(Bio-Rad Model 550,CA,USA)进行nm。计算相对细胞增殖率如下:[(OD CM处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%。每组进行六次重复三次。

凝胶收缩试验

在24孔塑料培养板中使用胶原凝胶格来评估造血干细胞的收缩性。将I型鼠尾胶原蛋白(BD Bioscience, Bedford, MA)、10 × DMEM (Solarbio Science & Technology, Beijing, China)和0.1 mol/L NaOH混合制成胶原凝胶。将胶原蛋白溶液与HSC悬液混合至胶原蛋白浓度为1 mg/ml,细胞密度为2 × 10的最终溶液5.细胞/毫升。将混合胶原凝胶液500微升加入24孔培养板的每孔中,37℃孵育1小时,使其凝胶化。将胶原凝胶置于完全培养基中(0.5 ml/孔),置于培养箱中过夜。然后用无血清培养基培养胶原凝胶细胞4 h。PBS冲洗3次后,用10 μl微管尖将胶原凝胶从每个孔的外壁分离。如上所述,用血清替代细胞培养基,再用胶原凝胶培养细胞24 h。使用Image-Pro Plus 5.0对每种凝胶进行拍照和分析。hsc收缩性的测定方法为:100%-凝胶表面积/基底面积× 100%。

磷酸化抗体阵列分析磷酸化蛋白

LX-2细胞的裂解液经CM-C、CM-C + HBeAg (2 μg/ml)和CM-E处理后,根据制造商的协议,使用Phospho Explorer抗体阵列(PEX100, Full Moon Biosystems Inc.)检测。如前所述分析不同组中每个标记的磷酸化比率[23.].

磁复合法测定细胞因子

细胞培养上清液中的炎症细胞因子根据制造商的指南通过磁性Luminex性能分析(研发系统)进行评估。a Luminex X-200(Luminex,Austin,TX)使用R&D分析软件中的5参数logistic曲线拟合确定细胞因子的绝对浓度。

表面可达肽的预测

免疫表位数据库(IEDB)的Emini表面可及性预测工具用于使用默认阈值水平1.0预测HBeAg核心结构域(ΔRP-E)的表面可及性肽[24.].

统计分析

采用SPSS v22.0软件(SPSS Inc, Chicago, USA)进行统计学分析。连续变量结果用均数±标准差表示,分类变量用频数或百分比表示。学生的T根据至少三个独立实验,使用检验或单因素方差分析(ANOVA)分析各组之间的显著差异。使用卡方检验、Mann-Whitney检验和Student's检验评估临床数据的组间差异T-使用斯皮尔曼相关系数表征参数之间的关系。P< 0.05被认为有统计学意义。

结果

TLR-2是HBeAg激活巨噬细胞的直接结合受体

我们之前的研究发现HBeAg可以诱导巨噬细胞活化[10.].为了进一步分析HBeAg在巨噬细胞中的识别受体,我们首先检测典型细胞因子在2 μg/ml剂量下的动力学,以确定最佳检测时间点(图)。1.A–F)。巨噬细胞中TNF-α和IL-6的表达在最早的时间点被诱导(2) h) ,然后大约在4时达到最高水平 h在HBeAg刺激后。因此,在4时检测到以下数据 h HBeAg治疗后。为了全面了解HBeAg对巨噬细胞的调节作用,应用RNAseq分析。值得注意的是,除了炎症细胞因子外,还观察到TLR的显著变化,如热图所示(图。1.因此,我们采用qRT-PCR方法分析小鼠和人巨噬细胞中TLRs的绝对表达情况,进一步验证这一发现(表)3.)我们发现TLR表达大致可分为3个水平:可比高(TLR-2)、中等(TLR-1、TLR-4、TLR-6、TLR-7和TLR-9)或极低(TLR-3、TLR-5和TLR-8)。TLR-2表达在经PMA预处理的THP-1细胞中上调最明显(4.05倍),而TLR-3表达在RAW 264.7巨噬细胞中上调最明显(55.53倍)。作为TLR-2的共同受体,TLR-1和TLR-6在所有三种细胞系中的表达都略有增强(1-3倍)。相反,HBeAg诱导TLR-5和TLR-7表达水平显著降低(29–64%)。由于三种巨噬细胞系中TLR-5的表达均极低,且在HBeAg治疗后显著降低,因此表明其在HBeAg识别中的作用可忽略不计。

图1
图1

HBeAg调节巨噬细胞中多个TLRs的表达,而HBeAg诱导的巨噬细胞的炎症反应被TLRs抑制。用HBeAg (2 μg/ml)在不同时间点刺激RAW 264.7巨噬细胞,采用qRT-PCR分别检测IL-6和TNF-α的表达(A.,D).THP-1(B,E)和U937细胞(C,F)用最终浓度为50%的PMA进行预处理 ng/ml。更换新鲜培养基后,用HBeAg(2 用qRT-PCR检测IL-6和TNF-α的表达,HBeAg刺激RAW264.7巨噬细胞24小时 h、 进行RNA测序分析,选择并显示生长因子、细胞因子、趋化因子和TLR的表达谱(G).H4°C与HBeAg孵育1 h后,RAW 264.7巨噬细胞在室温下用1%多聚甲醛固定20分钟。阻断后,用Alexa Flour 488标记的一抗在37℃孵育1小时,然后用DAPI进行核染色,然后用共聚焦荧光显微镜捕捉细胞。RAW 264.7巨噬细胞和pma预处理的THP-1/U937细胞用DMSO或tlr - 2,4,8,7 /9抑制剂(10μΜ)处理30分钟。HBeAg处理24 h后分析细胞形态().箭头表示激活的巨噬细胞。RAW 264.7巨噬细胞先用DMSO或tlr - 2,4,8,7 /9抑制剂处理30 min,然后用HBeAg处理4 h。分别用qRT-PCR和ELISA检测IL-6、TNF-α和IFN-β的表达和分泌情况(JL).PMA预处理THP-1(MN)和U937细胞(OP)分别用DMSO或tlr - 2,4,8,7 /9抑制剂处理30 min,然后用HBeAg处理4 h。分别采用qRT-PCR和ELISA检测IL-6和TNF-α的表达和分泌情况。巨噬细胞包括RAW264.7、pma预处理的THP-1和U937细胞,先用DMSO或tlr - 2,4,8,7 /9抑制剂(10μΜ)处理30 min,然后再用HBeAg处理20 min。蛋白印迹法检测p65的磷酸化水平(Q)此外,还测定了TLR-2/4抑制剂对p65核易位的影响(R).将TLR-3或阴性对照的siRNA转染到Raw264.7巨噬细胞中48小时,然后用HBeAg处理细胞4小时。TLR-3的表达是通过Western印迹测定测试的(s)和IL-6和IFN-β的水平(T)通过QRT-PCR测试。将TLR-3或阴性对照的siRNA转染到Raw264.7巨噬细胞中48小时,然后用HBeAg处理细胞20分钟。分别测试P65的磷酸化水平和核易位(U-v).*P<0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001

表3 TLR1-9在RAW264.7、U937和THP-1细胞中的表达

为了确定HBeAg是否能够与TLR相互作用,尽管它能够调节TLR的表达,我们首先通过免疫荧光分析确定了HBeAg激活巨噬细胞时的位置。如图所示。1.H, HBeAg主要位于细胞边界,表明tlr可能在这一过程中发挥一定作用。接下来,巨噬细胞用TLR-2 (C29)、TLR-4 (resatorvid)、TLR-7/9(硫酸羟氯喹)和TLR-8 (CU-CPT9b)抑制剂预处理30分钟,然后用HBeAg处理。我们观察细胞形态和不同细胞因子的表达,以筛选潜在的结合受体。如图所示。1.I,经硫酸羟氯喹和CU-CPT9b预处理的巨噬细胞继续变得伸展和多向,表明巨噬细胞被激活[25.],而经C29和resatorvid预处理的巨噬细胞未被激活,保持圆形形态。同时,从形态学上看,C29和resatorvid预处理组的炎性细胞因子水平较单独HBeAg处理组明显降低(图)。1.我们以前的研究证实HBeAg通过NF-κB信号通路促进细胞因子的产生[10.]因此,我们进一步检测了经上述多种抑制剂处理的巨噬细胞中p65的磷酸化水平和核转位。1.Q–R,经硫酸羟基氯喹和CU-CPT9b预处理的巨噬细胞p65的磷酸化水平没有或只有轻微的减弱。然而,在C29-或再供体预处理的细胞中,p65的磷酸化和核转位显著下降。此外,为了评估TLR-3(无相应的抑制剂)的参与情况,RAW264.7用TLR-3特异性siRNA转染巨噬细胞。我们在转染后第2天用seq-3证实了TLR-3最明显的减少(>50%)(图。1.S),因此在以下分析中使用了seq-3。转染tlr -3特异性sirna后,IL-6和IFN-β的表达被显著抑制(~ 50%)(图。1.如图所示,p65的磷酸化和核易位也被阻断。1.总之,上述结果表明TLR-2/3/4在HBeAg诱导的巨噬细胞活化中起着关键作用。

接下来,我们使用抗体阻断实验进行进一步验证。2.A、 TLR-2阻断抗体而非TLR-3/4阻断抗体最显著地削弱了IL-6的产生。因此,我们在以下分析中针对TLR-2。此外,我们使用TLR-2的siRNA敲除研究了对hMDM的影响。到第2天,使用seq-2的TLR-2蛋白表达最显著地降低(图。2.B).根据上述结果,在HBeAg刺激组中,TLR-2的敲除抑制了TNF-α和IL-6的产生(图)。2.C, D)。在C29预处理的小鼠Kupffer细胞中也可以检测到类似的结果(图。2.为了确定HBeAg是否能直接与TLR-2相互作用,我们首先与TLR-2胞外段重组蛋白进行共免疫沉淀试验。我们的数据显示HBeAg可以在体外直接与TLR-2相互作用(图2)。2.此外,HBeAg在体内也能与内源性TLR-2相互作用(图2)。2.一) 。

图2
figure2

TLR-2是HBeAg激活巨噬细胞时的直接结合受体。用同型IgG或TLR-2/3/4 (5 μg/ml)阻断抗体预处理30 min后,用HBeAg刺激RAW264.7巨噬细胞4 h。采用qRT-PCR和ELISA分析IL-6的表达和分泌情况(A.).将TLR-2或阴性对照的siRNA转染到HMDM中48小时,然后用HBeAg处理细胞4小时。TLR-2的表达是通过Western印迹测定测试的(B)和IL-6水平(C)和TNF-α(D),采用ELISA法检测。用DMSO或TLR-2抑制剂处理小鼠Kupffer细胞30 min,然后用HBeAg处理4 h。白细胞介素-6 (E)和TNF-α(F)Co-IP分析了重组GST-HBeAg与重组TLR-2蛋白细胞外段的直接结合(G,H).RAW264.7巨噬细胞用GST-HBeAg处理(2 μg/ml)用于1 h、 然后裂解细胞,将细胞裂解与GST抗体或同种型IgG在4°C下孵育过夜,并通过western blot分析内源性TLR-2与重组GST-HBeAg之间的直接结合().将TLR-1、TLR-6或阴性对照的sirna转染RAW264.7巨噬细胞48 h,然后用HBeAg处理细胞4 h。分别用western blot法检测TLR-1和TLR-6的表达(J,M),以及相应的IL-6水平(K,N)和TNF-α(L,O)分别用ELISA法进行检测。将TLR-1、TLR-6或阴性对照的siRNA转染PMA预处理的THP-1巨噬细胞48小时 h、 然后用HBeAg处理细胞4周 Hwesternblot检测TLR-1和TLR-6的表达(P,s),以及相应的IL-6水平(Q,T)和TNF-α(R,U)分别用ELISA法进行检测*P<0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001

最后,区分哪个共同受体参与TLR-2介导的识别和活化,我们特异性地敲下TLR-1和TLR-6(图。2.J和M)并测量细胞因子的变化。在Raw264.7巨噬细胞中,与TLR-6相比,针对TLR-1的靶向siRNA的敲低导致HBEAG诱导的IL-6和TNF-α产生的抑制(图。2.K、 在PMA预处理的THP-1细胞系中观察到类似的TNF-α诱导结果(图。2.这些结果表明TLR-1可能在HBeAg诱导的TLR-2信号通路的激活中发挥更重要的作用。

HBeAg的C端肽在巨噬细胞活化中起关键作用

HBeAg(P17)从突出的前体蛋白(P25)加工,用N-和C末端被截短,并与HBCAG分享149个残基的共同核心结构域(P21)(图。3.A).然而,根据我们之前的研究结果,HBcAg与HBeAg不同,因为它不能显著诱导小鼠巨噬细胞活化[10.].为了消除可能由物种差异引起的影响,我们将重组HBcAg添加到pma预处理的THP-1和U937细胞中4 h。一致地,我们发现IL-6和TNF-α的分泌和表达在这两种细胞系中也没有明显的诱导作用(图)。3.B, C)。

图3
图3

HBeAg的C端肽在巨噬细胞活化中起着关键作用。HBeAg、HBcAg及其前体蛋白结构的比较(A.)PMA预处理的THP-1/U937细胞用2 μg/ml HBcAg用于4小时 h、 分别用qRT-PCR和ELISA检测IL-6和TNF-α的表达和分泌(B,C).用HBeAg、HBcAg、ArD和ΔRP-E (2 μg/ml)分别刺激RAW264.7巨噬细胞4 h,然后采用qRT-PCR和ELISA检测IL-6和TNF-α的表达和分泌情况(D).预测HBEAG(上部)和HBCAG(下部)的表面可接近肽的生物信息分析(E).HBeAg野生型和截断突变体示意图(F).RAW264.7用ΔRP-E和HBeAg截短突变体刺激巨噬细胞(2 μg/ml),然后通过qRT-PCR和ELISA检测IL-6和TNF-α的表达和分泌(G,H).*P<0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001

接下来,我们旨在研究HBeAg对巨噬细胞激活的功能域,以进一步解释HBeAg和HBcAg之间的免疫原性差异。积累的数据表明,HBeAg的N端前肽决定了相对于HBcAg和富含精氨酸结构域(ArD)根本不同的分子结构HBcAg的表达是IL-18产生的先决条件[26.].因此,我们合成了重组蛋白ArD andΔRP-E (n端10-残基前肽删除HBeAg),并用其处理巨噬细胞。如图所示。3.D,IL-6和TNF-α的表达和分泌在ΔRP-E刺激组中比全长HBEAG的表达和分泌更大,而ARD和HBCAG与对照相比几乎没有引发任何变化。此外,我们对表面可接近的肽进行了生物信息学分析,表明HBeAg的可偏转肽分散在核心结构域(AA。1-17,29-96,122-143)的三个部分中散射,而浓缩HBCAG在富精氨酸的终端(图。3.(E)因此,我们推测HBeAg的核心结构域负责促进巨噬细胞的激活,但在此过程中,由于额外的ArD,HBcAg对其免疫原性产生负面影响。此外,三种删除上述可及肽的重组HBeAg蛋白被用于确认其激活巨噬细胞的能力年龄分开(图。3.F)。ΔAA。与其他相比,巨噬细胞的刺激性刺激性最小,表明AA。122-143在HBeAg中对于巨噬细胞激活至关重要(图。3.g,h)。

HBeAg以巨噬细胞依赖的方式促进肝星状细胞的活化

为了分析HBeAg是否可以直接或以巨噬细胞依赖的方式激活HSC,我们将HBeAg激活的巨噬细胞中的CM添加到人LX-2星状细胞中24小时 令人惊讶的是,在不同的组中没有检测到α-SMA、胶原和纤维连接蛋白水平的显著差异(图。4.a - c)。同样的结果也可以在RAW264.7细胞CM处理的原发性肝星状细胞中检测到(图。4.D).在肝纤维化的持续过程中,活化的造血干细胞不仅通过纤维细胞外基质的积累,还通过其增殖、运动和收缩表型发挥促纤维化作用[27.].如图所示。4.E, CM-E处理的细胞对血清的趋化性最强,而HBeAg处理的细胞与对照相比没有明显的趋化性。此外,造血干细胞的增殖也表现出与活性相同的趋势(图。4.G)。此外,对照组胶原晶格的表面积明显减少,其程度与HBeAg处理的造血干细胞相似(图)。4.F).与CM-C处理相比,CM-E处理的胶原晶格收缩更明显。

图4
装具

HBEAG以巨噬细胞依赖性方式促进肝星状细胞的激活。将LX-2星状细胞用HBeAg(2μg/ ml),Cm-C或CM-E处理,从Raw264.7巨噬细胞处理(A.)或U937细胞(B)24小时 h、 通过qRT PCR检测α-SMA、胶原1a1和纤维连接蛋白的表达。同样,通过western blot检测其在LX-2细胞和原代肝星状细胞中的表达(C,D).LX-2星状细胞用HBeAg(2 μg/ml),CM-C或CM-E从U937细胞中提取24小时 h、 检测收缩、增殖和迁移表型(EG).检测HBeAg或CM-E处理后富集通路的log2转化磷酸化信号。将信号归一化为各自的总蛋白,然后再进行CM控制。热点图:与车辆相比,红色表示信号增加,黑色表示没有变化,绿色表示信号减少(H).利用western blots验证了CM-E富集通路的关键信号中间体().将LX-2细胞用CM和富集途径抑制剂(10μΜ)或与对照相同体积的DMSO处理,然后测试收缩性、增殖和迁移表型(JL).用HBeAg (2 μg/ml)在不同时间点刺激RAW264.7巨噬细胞,用Magnetic Luminex Performance Assay (M).*P<0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001

hbeag处理的巨噬细胞的条件培养基通过不同的信号通路介导HSC的激活

为了研究CM-E调控造血干细胞激活的机制,我们使用Phospho Explorer抗体芯片检测和分析特定条件下的磷酸化事件。总的来说,我们鉴定出92个蛋白至少有50%的磷酸化减少,90个蛋白至少有100%的磷酸化增加。利用KEGG和通路图分析对这些关键通路进行分析。与CM或2 μg/ml HBeAg CM相比,CM- e显著改变的信号通路为ErbB和mTOR信号通路,主要由MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT信号通路组成。TGF-β信号通路是仅受CM-E影响的主要信号通路。上述途径的具体磷酸化位点如图所示。4.H和关键的信号转导中间体通过western blots进行验证(图。4.I).为了进一步揭示CM-E诱导HSC表型的信号通路,我们用这些通路的抑制剂预处理LX-2细胞30分钟,然后再用CM-E处理。虽然它们都可能在CM-E诱导的表型中发挥一定作用,但PI3K-AKT-mTOR和p38 MAPK信号通路对运动性的影响更为显著(图)。4.J) 以及星形细胞增殖和收缩的Smad依赖性TGF-β信号通路(图。4.k,l)。为了分析负责表型的可溶性因子,使用磁性Luminex性能测定筛选CM-E的各种细胞因子,趋化因子和生长因子的水平(图。4.m)。值得注意的是,诸如CCL2,CCL5,CXCL10和TNF-α的可溶性因子早在刺激后表现出明显的分泌,比通过对照巨噬细胞产生的那些高出9-137倍。此外,他们以前据报道是炎症和肝纤维化的关键调节因子[15.,28.]因此,我们有理由相信,HBeAg诱导的巨噬细胞上清液中的这些可溶性因子可能是HSC活化的关键成分。

HBeAg通过TLR-2诱导巨噬细胞炎症和纤维化反应

为了分析体内HBeAg的免疫反应,C57BL/6小鼠静脉注射重组HBeAg 40 4、8、12和24μg h、 如图所示。5.A、 在4-12小时内,有少量小的炎性浸润,但未检测到明显的肝坏死区(LPS和ConA诱导的肝炎的常见现象) h、 这与细胞因子的瞬时表达一致(图。5.B-E),提示HBeAg参与了肝炎症的诱导。同时,血清ALT和AST在不同检测时间均轻度升高(图2)。5.此外,在急性CCL中评估了HBeAg对纤维形成的影响4.在小鼠模型。F4/80与α-SMA共免疫荧光显示CCL后注射HBeAg4.治疗加重巨噬细胞浸润和HSC激活。然而,单个HBEAG注射不能明显触发HSC激活(图。5.H)同时,CCL后注射HBeAg4.治疗有助于造血干细胞的增殖和运动,并提高血清ALT(图。5.因此,HBeAg可以促进肝损伤和肝纤维化的进展,而不是其起始的主要原因。为了进一步阐明巨噬细胞在体内的作用,我们通过在HBeAg或CCL之前注射含氯膦酸脂质体来清除巨噬细胞4.治疗。几乎所有巨噬细胞在第1天和第4天被氯膦酸盐耗尽,F4/80蛋白表达降低证明了这一点(图。5.K) 。在HBeAg单独治疗或CCL诱导的纤维化进展中,巨噬细胞耗竭导致生长因子、细胞因子、趋化因子、α-SMA和胶原的表达显著降低4.(图。5.L–T)。最后,为了验证TLR-2在体内的作用,在给予HBeAg之前用C29对小鼠进行预处理。我们发现IL-6、TNF-α和CCL-2的表达显著减轻(图。5.U-W),但IL-10在肝脏中上调(图。5.X)。

图5
figure5

HBeAg通过巨噬细胞中的TLR-2在体内诱导炎症和纤维化反应。雄性Balb/c小鼠(每组5只)尾静脉注射重组HBeAg 40 μg或同等体积的PBS,然后在4、8、12和24时处死 肝切片HE和F4/80染色(A.)通过qRT-PCR检测肝脏mRNA水平(BE)检测血浆ALT和AST水平(F,G).雄性Balb/c小鼠(每组5只)给予CCl治疗4.(1 ml/kg(橄榄油中),同时静脉注射HBeAg 40 肝切片用α-SMA、F4/80、结蛋白和ki67染色(H,).检查血清ALT的水平(J).雄性Balb/c小鼠在CCl前腹腔注射氯膦酸脂质体0.2 ml (7 mg/ml)或对照组脂质体4.在第1天和第4天通过F4/80染色检查单核细胞的消耗效率(K).通过qRT-PCR检测HBeAg处理4 h小鼠肝脏mRNA水平(LO).CCl处理小鼠肝脏的mRNA水平4.分别用qRT-PCR检测HBeAg (PT)腹腔注射TLR-2抑制剂(C29)(1.3 μmol/g)1 HBeAg治疗前h(40 μg/只小鼠),与溶媒组(每组5只小鼠)相同体积的溶解试剂,通过qRT-PCR检测肝脏mRNA水平(UX).*p =0.05, * *P< 0.01, ***P< 0.001

HBeAg水平与HBV感染患者的炎症和纤维化程度相关

为了验证我们在HBV感染患者中的结果,我们招募了61例AHB患者和151例CHB患者。作为病毒复制的一个指标,HBeAg水平与AHB患者的HBV DNA载量呈正相关(图)。6.此外,这些患者的血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平随HBeAg升高而升高(图2)。6.B, C)。

图6
figure6

与HBV感染患者的炎症和纤维化程度相关的HBEAG水平。HBEAG水平与HBV DNA含量之间的关联(A.)、ALT (B),及AST(C)在AHB患者中分析。比较HBeAg组的肝脏炎症分级-和HBEAG.+慢性乙肝患者(D).肝切片用CD68染色(E),比较显著炎症分级(G≥2)的CHB患者与显著炎症分级(G≤1)的CHB患者cd68阳性区域(F).分析HBeAg水平与cd68阳性区域的相关性(G).比较HBeAg组肝纤维化分期及chb相关并发症的发生率-和HBEAG.+病人(H,).肝脏部分与他和α-sma染色(K), 20例HBeAg检测HBeAg水平及α- sma阳性区域+病人(J).*P<0.05,**P< 0.01, ***P< 0.001

接下来,我们分析了慢性乙型肝炎患者HBeAg水平与纤维化分期和炎症分级之间的关系。6.D,HBEAG肝脏炎症等级较高+患者比HBEAG-然而,只有在G=0和G之间才能达到统计学意义≥ 1 (P= 0.030)。免疫组化分析HBeAg中单核细胞和巨噬细胞的标记物CD68+病人(N=(图45)。6.E) CD68的阳性区域在有明显炎症分级的患者中更高(G≥ 2) (图。6.f),表明其CHB患者肝脏炎症活性的密切关系。同时,在CD68之间观察到显着的相关性+细胞浸润及HBeAg水平(R= 0.557,P= 0.003,图。6.此外,HBeAg组肝纤维化更严重+患者比HBEAG-病人(P= 0.004,无花果。6.H)。始终,e抗原+患者出现肝硬化相关并发症的发生率较高,如食管静脉曲张(EVs)、腹水和脾肿大,尽管只有EVs的发生率达到统计学意义(图)。6.I).此外,20例HBeAg检测到α-SMA+病人(图。6.如图所示。6.J,其阳性染色区域与HBeAg水平呈正相关(R= 0.515,P=0.014)。综上所述,我们证明HBeAg可能是HBV感染患者肝脏炎症和纤维化反应的重要调节因子。

讨论

HBV感染是一个重要的公共卫生问题。HBV感染的主要危害在于免疫系统激活引起的持续性肝损伤,并伴随伤口愈合反应,最终导致肝硬化及其相关并发症的发生。巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分,是肝脏抵抗病原体的第一道防线。在感染过程中,巨噬细胞可以通过PRR感知HBV病原体相关分子模式的存在,并进一步分泌大量炎症细胞因子来介导炎症反应。此外,巨噬细胞还能够促进有效的适应性免疫,促进T细胞反应和B细胞介导的抗体分泌。此外,肝纤维化是由慢性HBV感染期间持续的低级别损伤引起的,其形成的最重要机制之一是HSC和巨噬细胞之间以旁分泌方式相互作用[29.].积累的数据表明,巨噬细胞在炎症瘢痕的损伤和恢复阶段都发挥着重要作用[30.].

对巨噬细胞病原体的感测和反应主要由PRR介导,包括清除剂受体,TLR,钻机样受体,点状受体和C型凝集素[31.]巨噬细胞可以检测和识别HBV颗粒及其相关蛋白,从而激活表面和/或细胞内受体,产生病毒抑制性细胞因子[8.].最近,HBV与体内巨噬细胞的直接相互作用仅存在有限的信息。据报道,TLR-2和硫酸乙酰肝素蛋白多糖负责HBCAG识别,因此导致IL-6,IL-12P40和TNF的产生[5.].然而,HBcAg仅存在于受感染的肝细胞或病毒颗粒中,我们的数据已经证实,HBcAg不能在小鼠或人的巨噬细胞中显著诱导巨噬细胞活化。因此,巨噬细胞可能有其他方法来识别HBV。此外,HBsAg能以cd14依赖的方式刺激人血单核细胞[32.],与白蛋白复合物的形成可能增加库普弗细胞对其的摄取[33.].有趣的是,对于树突状细胞,HBsAg的内化是通过甘露糖受体介导的[34.,所以我们可以推测同一种病毒蛋白能够在不同的结合位点触发免疫反应。现有证据表明,HBeAg与mIL-1RAcP的相互作用可能通过IκB降解激活下游NF-κB信号通路,从而触发宿主IL-1应答[35].在本研究中,我们进一步验证了TLR-2是HBeAg在体内和体外激活巨噬细胞时的直接结合受体,HBeAg c端肽是HBeAg诱导巨噬细胞激活的分子基础。这一发现为hbv诱导的巨噬细胞活化提供了一种新的机制。

另一方面,HBV颗粒及其相关蛋白可能在一定程度上抑制免疫反应并导致持续感染。有趣的是,在这方面存在物种特异性差异,其主要特征是在我们的研究中,TLR的表达及其由HBeAg诱导的调节存在差异在未激活状态下,小鼠巨噬细胞中几种TLR的表达高于人类巨噬细胞,尤其是TLR-2、TLR-7和TLR-9。因此,我们的结果表明,与人类巨噬细胞相比,小鼠巨噬细胞中的炎症反应更为明显,这一发现可能解释HBV可以在h此外,一些优秀的综述还指出,TLR结构、序列和定位模式的差异也可能决定不同物种的不同功能[36.,37.,38.].此外,HBeAg诱导的免疫逃逸机制在小鼠和人类之间可能并不相同。我们观察到TLR-2在小鼠巨噬细胞中表达最高,而HBeAg刺激后其表达降低最显著。然而,对于人巨噬细胞,HBeAg可能主要降低与IFN产生相关的TLR-3的表达。总的来说,我们的研究结果也验证了之前的发现,HBV可以下调TLR的表达,从而抑制巨噬细胞的抗病毒反应,促进免疫耐受[29.]此外,通过治疗TLR-7和TLR-5配体可以消除HBV复制,这意味着这些受体可能在抑制HBV复制中发挥关键作用[39.]然而,在HBeAg处理的小鼠和人巨噬细胞中,这两种基因均下调,提示HBV诱导的免疫逃逸和耐受的另一种新机制。针对同一目标,HBV也可能直接促进体内的抗炎反应。HBV携带者小鼠中的Kupffer细胞表达更多IL-10,并介导了e以IL-10依赖的方式诱导系统耐受[40].一致地,在病毒血症的高峰期,在抑制淋巴细胞激活期间,急性HBV感染患者的血清中观察到IL-10的峰值[41]在这项研究中,HBeAg还诱导肝脏中IL-10的表达,而IL-10在经TLR-2抑制剂预处理的小鼠中更明显地上调,这表明HBeAg在这一过程中也可能靶向其他信号通路介质。因此,TLR-2的表达可能抵抗HBV感染期间免疫耐受的形成目前,原代人肝细胞最近被报道通过TLR-2感应HBV颗粒,导致体外抗HBV免疫反应的激活[42].今后应进一步重视其作用机制和临床意义。最后,Lang等人发现HBeAg的前肽与TIR motif相似,从而通过扰乱同型TIR来抑制TIR介导的炎症反应激活:TIR相互作用[43].因此,HBeAg是hbv相关抗原激活巨噬细胞中最关键的蛋白,其核心结构域(ΔRP-E)比HBeAg和HBcAg更能触发细胞因子的表达和分泌。此外,c端ArD是唯一的,也是HBcAg唯一的表面可达区域,之前的研究表明,HBcAg可能以依赖ArD的方式促进巨噬细胞诱导细胞因子[5.].但在本研究中,无论是HBcAg还是ArD均不能显著诱导巨噬细胞活化,我们推测ArD与HBeAg的前肽一样,也可能在抑制促炎分泌中发挥关键作用。综上所述,免疫反应的激活和抑制可能在HBV感染过程中共存。

在HBV感染微环境中,证明活化的巨噬细胞通过直接或间接激活HSC来参与肝纤维化[31.].实际上,CD16的数量增加+和CD163+巨噬细胞与慢性乙型肝炎患者更高的组织学活性和纤维化程度相关[22.,44],而巨噬细胞在hbv相关纤维化发展中的致病作用尚未阐明。为了确定HBeAg在hbv相关纤维化发病机制中的作用,我们使用无血清CM刺激造血干细胞,因为血清中含有生长因子和细胞因子,可能掩盖了巨噬细胞来源的介质对肝星状细胞产生的潜在影响[45].我们发现HBeAg诱导的巨噬细胞依赖性方式可增强HSC的增殖、收缩和运动。与体内研究结果一致,HBeAg是永久性纤维化的介质,其特征是促进HSC的活化,从而加剧肝纤维化。相反,HBeAg本身不能激活HSC,从而导致肝纤维化直接吃HSC,即使HSC确实表达TLR-2。这种现象可归因于HSC中TLR-2的极低表达(表1)3.和附加文件1.:表S1)。此外,HBeAg处理后,hsc中TLR-2的表达几乎没有变化。综上所述,造血干细胞和巨噬细胞在识别HBeAg过程中可能发挥着不同的作用,而HBeAg诱导的造血干细胞的活化需要巨噬细胞的帮助。此外,我们还探索了这些表型的信号通路。smad依赖的TGF-β信号通路通常被认为是最有效的纤维化通路[15.]除此之外,许多研究还发现TGF-β通过与其他信号通路的串扰以非Smad依赖的方式发挥作用,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶点磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT和Rho-GTPase途径[46].在本研究中,HBeAg诱导的活化造血干细胞表型往往受到多种途径的调控。smad依赖的TGF-β信号通路负责星状细胞的增殖和收缩,而PI3K-AKT-mTOR和p38 MAPK信号通路在造血干细胞的运动中可能发挥更重要的作用。这些数据表明hsc的激活可能通过smad依赖和smad独立的途径调控,进一步的研究应该用Smad2和Smad3敲除模型来验证这一结论。除TGF-β外,各种生长因子、细胞因子、趋化因子如IL-6、TNF-α、IL-1、PDGF、CCL2等也可能作为巨噬细胞释放的信使因子调控造血干细胞的表型。因此,巨噬细胞和造血干细胞之间通过可溶性蛋白的特异性串话可以作为进一步研究的一个方面。

临床上,持续炎症反应引起的肝纤维化进展是CHB患者预后不良的重要因素。HBeAg状态通常被认为是区分CHB自然史阶段的重要血清标志物。目前,HBeAg水平与病理性纤维化/炎症程度之间的关系仍存在争议。在这项研究中,我们证明了HBeAg+状态与慢性乙型肝炎患者较高的炎症或纤维化程度有关,这与以往的研究一致[47,48,49].值得注意的是,招募的CHB患者的平均年龄为54岁,因此我们可以排除绝大多数具有免疫耐受的患者,这些患者通常小于30岁,表现为HBeAg阳性,但对病毒没有明显的免疫应答[50].此外,在HBEAG状态和轻度肝炎症等级之间观察到更密关系(G≥1);因此,我们抑制了HBeAg可能在诱导早期炎症反应方面发挥更重要的作用。然而,如上所述的其他HBV相关组分可能导致持续的炎症反应。即使一些研究已经建立了HBEAG+状态与显著的肝纤维化独立相关[47,我们进一步发现血清HBeAg浓度升高,HBeAg中有CD68和α- sma阳性区域+因此,临床数据证实了我们的发现,HBeAg通过巨噬细胞依赖性方式促进肝纤维化。

总之,我们的结果表明,HBEAG通过影响TLRS和信号途径激活的表达介导通过巨噬细胞诱导的先天免疫应答。此外,我们验证了TLR-2是HBEAG的直接结合受体,HBeAg中的C-末端肽(122-143AA)的核心结构域对巨噬细胞活化至关重要。此外,HBEAG在巨噬细胞依赖性方式中促进了HSC的增殖,收缩和动力。机械地,PI3K-AKT-MTOR和P38 MAPK信号途径有助于HSC的动力,而依赖于依赖于SMAD的TGF-β信号途径促进了它们的增殖和收缩。另外,可溶性因子,例如CCl2,CCl5,CXCL10和TNF-α可能对这些上述表型负责。在体内,我们进一步证实HBeAg可能在早期炎症反应中发挥更重要的作用,促进肝纤维化的进展。在一起,我们通过TLS推出了HBV感染和先天免疫应答的新型相互作用,进一步扩大了对HBV诱导的肝纤维发生机制的理解(图。7.).

图7
figure7

HBeAg通过TLR-2介导的巨噬细胞炎症功能示意图,通过星状细胞激活导致肝纤维化

结论

HBeAg通过TLR-2/NF-κB信号通路激活巨噬细胞,并在巨噬细胞的帮助下促进造血干细胞的运动、增殖和收缩,进一步加重肝纤维化。

数据和材料的可用性

支持本研究发现的数据可由通讯作者在合理的要求下提供。

缩写

AHB:

急性乙型肝炎

方差分析:

单因素方差分析

ArD:

富含精氨酸结构域

CCK-8:

细胞计数Kit-8

卫生防护中心:

慢性乙型肝炎

CM:

条件培养基

CM-C:

从对照中收集的条件培养基

CM-E:

通过HBeAg从活化巨噬细胞收集的条件培养基

共同知识产权:

Co-immunoprecipitation

ECM:

细胞外基质

ELISA:

酶联免疫吸附测定

电动汽车:

食管静脉曲张

HBcAg:

乙型肝炎核心抗原

HBCRAG:

乙肝核心相关抗原

e抗原:

乙型肝炎e抗原

HBsAg:

乙型肝炎表面抗原

乙型肝炎病毒:

乙型肝炎病毒

肝细胞癌:

肝细胞癌

HSC:

肝星状细胞

IEDB:

免疫表位数据库

OD:

光密度

PRR:

模式识别受体

qRT PCR:

实时定量PCR

TLR:

Toll样受体

参考文献

  1. 1。

    世界卫生组织,《2017年全球肝炎报告》,2017年。https://apps.who.int/iris/handle/10665/255016

  2. 2。

    Stanaway JD, Flaxman AD, Naghavi M, Fitzmaurice C, Vos T, Abubakar I, et al.;1990年至2013年病毒性肝炎的全球负担:来自2013年全球负担疾病研究的结果。柳叶刀》。2016;388(10049):1081 - 8。https://doi.org/10.1016/s0140 - 6736 (16) 30579 - 7

    文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  3. 3.

    Yuen MF, Chen DS, Dusheiko GM, Janssen HLA, Lau DTY, Locarnini SA,等。乙型肝炎病毒感染。acta physica sinica, 2018; 37(4): 486 - 486。https://doi.org/10.1038/nrdp.2018.35

    文章谷歌学术搜索

  4. 4.

    侯旭,郝旭,郑明,徐超,王静,周锐,等。CD205-TLR9-IL-12轴通过促进NKT细胞与Kupffer细胞的相互作用,参与cpg诱导的HBsAg转基因小鼠肝脏过度敏感损伤。细胞免疫学报。2017;14(8):675-84。https://doi.org/10.1038/cmi.2015.111

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  5. 5.

    Cooper A,Tal G,Lider O,Shaul Y.乙肝炎病毒衣壳在巨噬细胞中的细胞因子诱导通过膜硫酸盐促进,涉及TLR2。J免疫酚。2005; 175(5):3165-76。https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.5.3165

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  6. 6.

    Levrero M,Zucman-Rossi J.HBV诱导的肝细胞癌机制。j肝醇。2016; 64(1个):S84-S101。https://doi.org/10.1016/j.jhep.2016.02.021

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  7. 7.

    Kramvis A, Kostaki EG, Hatzakis A, Paraskevis D. HBeAg与乙型肝炎病毒短视进化、传播性和临床表现相关的免疫调节功能Microbiol前面。2018;9:2521。https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02521

    文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  8. 8.

    Hösel M,Quasdorff M,Wiegmann K,Webb D,Zedler U,Broxtermann M,等。不是干扰素,而是白细胞介素-6控制乙型肝炎病毒感染的早期基因表达。肝病学。2009;50(6):1773-82。https://doi.org/10.1002/hep.23226

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  9. 9.

    吴杰,孟梓,姜敏,裴R,Trippler M,Broering R,等。乙型肝炎病毒抑制小鼠实质性和非实质性肝细胞中toll样受体介导的固有免疫反应。国际肝病学。2009;49(4):1132-40。https://doi.org/10.1002/hep.22751

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  10. 10。

    王伟,卞洪,李飞,张东,孙胜,等。HBeAg通过促进炎症细胞因子的产生,诱导巨噬细胞miR-155的表达加速肝损伤。中国生物医学工程学报。2018;45(14):2627-41。https://doi.org/101007/S00018-018-2753-8

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  11. 11.

    模式识别受体与炎症反应。细胞。2010;140(6):805 - 20。https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.01.022

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  12. 12.

    Chang S,Dolganiuc A,Szabo G.Toll样受体1和6通过丙型肝炎病毒核心蛋白和NS3蛋白参与TLR2介导的巨噬细胞活化。白血病生物学杂志。2007;82(3):479-87。https://doi.org/10.1189/jlb.0207128

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  13. 13。

    Lin YL,Hu YC,Liang CC,Lin SY,Liang YC,Yuan HP,等.肠病毒-71病毒样颗粒通过TLR4信号转导诱导人单核细胞源性树突状细胞的活化和成熟.公共科学图书馆·一期.2014;9(10):e111496。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0111496

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  14. 14

    王l,冯y,xie x,wu h,su xn,qi j等。Neuropilin-1通过在肝正弦内皮细胞中通过VEGFR2依赖性PI3K / AKT途径促进血管生成来加剧肝硬化。eBiomedicine。2019; 43:525-36。https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.04.050

    文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  15. 15

    肝星状细胞活化机制的研究。国际肝病杂志。2017;14(7):397-411。https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.38

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  16. 16

    肝星状细胞-巨噬细胞相互干扰与肝纤维化的关系。国际肝病杂志2020;40(3):307-20。https://doi.org/10.1055/s-0040-1708876

    文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  17. 17.

    欧洲肝脏研究协会。电子地址:easloffice@easloffice.eu。EASL 2017乙型肝炎病毒感染管理临床实践指南J乙醇。2017;67(2):370 - 98。https://doi.org/10.1016/j.jhep.2017.03.021

    文章谷歌学术搜索

  18. 18.

    Poordad FF。肝硬化的表现和并发症。医学文献综述。2015;31(5):925-37。https://doi.org/10.1185/03007995.2015.1021905

    文章PubMed谷歌学术搜索

  19. 19.

    Mederacke I,Dapito DH,AffòS,Uchinami H,Schwabe RF.从正常和纤维化小鼠肝脏中高产量和高纯度分离肝星状细胞。Nat Protoc.2015;10(2):305-15。https://doi.org/10.1038/nprot.2015.017

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  20. 20.

    法国METAVIR合作研究小组。慢性丙型肝炎患者肝活检解释的观察者内和观察者间差异。https://doi.org/10.1002/hep.1840200104

    文章谷歌学术搜索

  21. 21.

    Bedossa P,Poynard T.慢性丙型肝炎活动分级的算法:美他韦合作研究组.肝病学,1996;24(2):289-93。https://doi.org/10.1002/HEP.510240201.

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  22. 22。

    张jy,zou zs,黄安,张z,fu jl,xu xs等。超活化的促炎CD16单核细胞与慢性乙型肝炎患者的肝损伤和纤维化的严重程度相关。2011; 6(3):E17484。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017484

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  23. 23。

    冷静,黄发,海烨,田赫,刘伟,方烨,等.祛湿化瘀汤改善非酒精性脂肪性肝炎与抑制肠道丝裂原活化蛋白激酶途径有关.植物医学.2020;66:153135。https://doi.org/10.1016/j.phymed.2019.153135

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  24. 24。

    Sharmin r,伊斯兰教。人冠状病毒RNA定向RNA聚合酶中的高度保守的WDYPKCDRA表位可用作基于表位的通用疫苗设计。BMC生物信息学。2014; 15(1):161。https://doi.org/10.1186/1471-2105-15-161

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  25. 25。

    卞H,李菲,王伟,赵Q,高S,马J,等.细胞骨架重排的MAPK/p38调节可加速TLR4而非TLR3诱导巨噬细胞活化.国际医学杂志.2017;40(5):1495-503。https://doi.org/10.3892/ijmm.2017.3143

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  26. 26

    陈建军,陈建军,陈建军,等。乙肝核心抗原是健康人和乙肝患者外周血单个核细胞中白细胞介素-18的有效诱导剂。中华医学杂志。2003;71(1):31-40。https://doi.org/10.1002/jmv.10445

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  27. 27

    Iredale JP。肝纤维化模型:在实体器官中探索炎症和修复的动态本质。中国临床医学杂志。2007;117(3):539-48。https://doi.org/10.1172/JCI30542

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  28. 28

    Marra F,Tacke F.趋化因子在肝脏疾病中的作用.胃肠病学.2014;147(3):577–594.e1。

    中科院文章谷歌学术搜索

  29. 29.

    Faure Dupuy S,Durantel D,Lucifora J.肝巨噬细胞:乙型肝炎感染期间的朋友还是敌人?肝脏杂志,2018;38(10):1718-29。https://doi.org/10.1111/liv.13884

    文章PubMed谷歌学术搜索

  30. 30.

    Duffield JS, Forbes SJ, Constandinou CM, Clay S, Partolina M, Vuthoori S,等。巨噬细胞的选择性消耗揭示了肝脏损伤和修复过程中截然相反的作用。[J] .中华结核和呼吸杂志。2005;11 (1):56-65 .]https://doi.org/10.1172/JCI200522675

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  31. 31.

    Boltjes A, Movita D, Boonstra A, Woltman AM。枯否细胞在乙型和丙型肝炎病毒感染中的作用J乙醇。2014;61(3):660 - 71。https://doi.org/10.1016/j.jhep.2014.04.026

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  32. 32.

    Vanlandschoot P,Van Houtte F,Roobrouck A,Farhoudi A,Stelter F,Peterson DL等。乙肝表面抗原与单核细胞的LPS结合蛋白和CD14依赖性附着由颗粒的磷脂部分决定。J Gen Virol.2002;83(Pt 9):2279-89。https://doi.org/10.1099/0022-1317-83-9-2279

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  33. 33.

    赖特·TL,罗尔·费杰,琼斯·艾尔,魏西格尔·雷拉。大鼠肝脏对聚合白蛋白的摄取和代谢。清道夫受体的作用。胃肠病学。1988;94(2):443-52。https://doi.org/10.1016/0016 - 5085 (88) 90435 - 0

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  34. 34。

    《甘露糖受体作为乙型肝炎病毒表面抗原受体介导与肝内树突状细胞的相互作用》。病毒学。2009;393(1):84–90。https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.07.015

    中科院文章谷歌学术搜索

  35. 35。

    杨春英,郭涛,丁立平。人乙型肝炎病毒e抗原与细胞白细胞介素-1受体附属蛋白相互作用并触发白细胞介素-1反应。中国生物化学杂志。2006;281(45):34525-36。https://doi.org/10.1074/jbc.m510981200

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  36. 36。

    Werling D,Jann OC,Offord V,Glass EJ,Coffey TJ.变异问题:TLR结构和物种特异性病原体识别.趋势免疫学.2009;30(3):124-30。https://doi.org/10.1016/j.it.2008.12.001

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  37. 37。

    刘亚平,刘亚平。toll样受体4在不同动物中的表达和功能。Immunol前面。2014;5:316。https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00316

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  38. 38。

    Hamonic G,Pasternak Ja,Wilson HL。识别组织和跨种类中的茧状受体的保守的非典型定位模式。细胞组织res。2018; 372(1):1-11。https://doi.org/10.1007/s00441-017-2767-9

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  39. 39

    Isogawa M, Robek MD, Furuichi Y, Chisari FV。toll样受体信号抑制乙肝病毒体内复制。79 J微生物学报。2005;(11):7269 - 72。https://doi.org/10.1128/JVI.79.11.7269-7272.2005

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  40. 40

    徐磊,尹W,孙瑞,魏H,田Z。库普弗细胞衍生的IL-10在维持乙型肝炎病毒持续性小鼠体液免疫耐受中起着关键作用。肝病学。2014;59(2):443-52。https://doi.org/10.1002/HEP.26668

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  41. 41

    邓恩等。急性乙型肝炎病毒感染患者早期免疫反应的时间分析胃肠病学。2009;137(4):1289 - 300。

    中科院文章谷歌学术搜索

  42. 42.

    张Z,Trippler M,Real Ci,Werner M,Luo X,Schefczyk S,等。乙型肝炎病毒颗粒最初在感染原发性人肝细胞时激活Toll样受体2信号。肝脏。2020; 72(3):829-44。

    中科院文章谷歌学术搜索

  43. 43.

    乙型肝炎e抗原(HBeAg)靶向并抑制toll样受体信号通路的激活。J乙醇。2011;55(4):762 - 9。https://doi.org/10.1016/j.jhep.2010.12.042

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  44. 44.

    Dultz G,Gerber L,Farnik H,Berger A,Vermehren J,Pleli T等人。可溶性CD163是患者慢性感染乙型肝炎病毒的患者肝脏炎症和纤维化的指标。j病毒hepat。2015; 22(4):427-32。https://doi.org/10.1111/jvh.12309

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  45. 45.

    Nieto N.氧化 - 应激和IL-6介导Kupffer细胞对星状细胞的纤维化作用。肝脏。2006; 44(6):1487-501。https://doi.org/10.1002/hep.21427

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  46. 46。

    Dewidar B,Meyer C,Dooley S,Meindl-Badinter An。TGF-β在肝星状细胞活化和肝纤维发生的2015年中。2019; 8(11):1419。https://doi.org/10.3390/cells8111419

    中科院文章公共医学中心谷歌学术搜索

  47. 47。

    Lai M, Hyatt BJ, Nasser I, Curry M, Afdhal NH。慢性乙型肝炎感染中ALT持续正常的临床意义J乙醇。2007;47(6):760 - 7。https://doi.org/10.1016/j.jhep.2007.07.022

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

  48. 48。

    Kumar M,Sarin SK,Hissar S,Pande C,Sakhuja P,Sharma BC等。慢性乙型肝炎病毒感染的无症状患者的病毒学和组织学特征,ALT持续正常。胃肠病学。2008;134(5):1376-84。https://doi.org/10.1053/j.gastro.2008.02.075

    文章PubMed谷歌学术搜索

  49. 49。

    谢文强,黎志林,叶炳,冯杰,黄德达,袁仲杰,等。一项大型人群组织学研究显示,慢性乙型肝炎患者ALT升高与显著纤维化之间缺乏相关性。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032622

    中科院文章PubMed公共医学中心谷歌学术搜索

  50. 50.

    Vlachogiannakos J,Papatheodoridis GV.乙肝病毒:我应该治疗我的免疫耐受患者吗?肝脏杂志2016;36(补充1):93-9。https://doi.org/10.1111/liv.12996

    中科院文章PubMed谷歌学术搜索

下载参考

致谢

不适用。

资金

这项工作部分由国家自然科学基金(81770607, 81772626, 81600469,81570551)、山东省省重大科技专项计划(2015ZDXX0802A01)、中国临床医学科技创新计划(202019094)、WBE肝纤维化基金会资助。(CFHPC2021011)。

作者信息

从属关系

贡献

QJ、ZQ、XX进行了设计、调研、数据分析和论文撰写。XX和LH开发了该方法。XX, LC, SX, YZ, SS, TM进行实验并分析数据。BH和QC帮助设计了研究,分析了数据,审查了手稿。所有作者都参与了这份手稿的撰写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

通信齐建妮或者朱强

道德宣言

道德认可和参与同意

在纳入本研究之前,通过口头/书面方式获得每位患者/监护人的知情同意,本研究由山东第一医科大学附属山东省立医院伦理委员会批准。机构审查委员会(IRB)编号为LCYJ:NO.2018-037。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

补充资料

出版商说明

万博平台登陆网址Springer Nature在公布的地图和机构附属机构的管辖权主张方面保持中立。

补充信息

额外的文件1。

TLR-2在LX-2细胞中的表达。

权限

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谢旭东,吕洪,刘超。et al。HBeAg通过TLR2介导巨噬细胞的炎症功能,从而导致肝纤维化。BMC医疗19日,247(2021)。https://doi.org/10.1186/s12916-021-02085-3

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  • HBeAg
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