跳过主要内容gydF4y2Ba

组织或ctDNA PTPRD磷酸酶结构域有害突变作为非鳞NSCLC免疫检查点抑制剂的预后和预测生物标志物的鉴定和验证gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

随着免疫检查点抑制剂(ICIs)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的革命性进展,识别从ICIs获益的患者变得至关重要和紧迫。蛋白质酪氨酸磷酸酶受体类型(PTPRs)的基因组改变与ici反应的关系尚不清楚。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

对73例抗pd -(L)1治疗前的晚期NSCLC肿瘤进行全外显子组测序(WES),并收集相应的临床数据作为发现队列,以发现PTPR突变与ICI反应的关系。将具有WES或肿瘤组织来源DNA或循环肿瘤DNA (ctDNA)靶标测序数据的1920例NSCLC患者的7个公共队列合并的3个验证队列作为验证队列。肺腺癌(LUAD)队列(gydF4y2BangydF4y2Ba=586),分析其可能的抗肿瘤免疫机制。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在所有PTPRs中,PTPRD突变频率最高,非鳞NSCLC (ns-NSCLC)的PTPRD突变与更长的无进展生存期有关(PFS, 324 vs 63天,危险比(HR)=0.36,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0152)和更高的目标响应率(ORR,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0099)。在验证队列1 (gydF4y2BangydF4y2Ba=377),有组织PTPRD突变的nsclc患者PFS较好(9.10 vs 4.33个月,HR=0.62,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0184) and ORR (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.013)。在验证队列2 (gydF4y2BangydF4y2Ba=406),具有组织PTPRD突变的nsclc患者具有良好的总生存期(OS,超过40 vs 11.94个月,HR=0.57,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.011)。在验证队列3 (gydF4y2BangydF4y2Ba= 1137),NS-非小细胞肺癌患者的叶绿体DNA突变PTPRD有更长的PFS(6.97 VS2.73个月,HR = 0.63,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.028)及更高的or (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.047)。此外,磷酸酶域(phosphatase-mut)的有害突变,而不是其他突变(other-mut),是PTPRD预测效率的原因。此外,在验证队列3中,ctDNA磷酸酶mutt也作为一种预测性生物标志物,帮助识别从ICIs中获益大于化疗的患者(相互作用)gydF4y2BaPgydF4y2BaPFS=0.0506, OS=0.04)。单因素和多因素回归分析显示,磷酸酶-mut独立于PD-L1表达和肿瘤突变负荷(TMB)预测。在基于TCGA LUAD队列的硅分析中,发现磷酸酶突变患者的抗肿瘤免疫增强。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在nsclc患者中,组织或ctDNA PTPRD磷酸酶结构域有害突变可能作为预测ICIs临床结局的预后和预测性生物标志物,与TMB或PD-L1表达无关。gydF4y2Ba

同行评审报告gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

尽管免疫检查点抑制剂(ICIs)最近在治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者中显示出了有希望的生存优势[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba],只有少数患者对目前的免疫治疗有反应[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba].因此,识别确定的响应的生物标记的ICI是势在必行的目标。迄今为止,程序性死亡配体1(PD-L1)的表达和肿瘤突变负担(TMB)是ICI不变两个预测生物标记物已在关于非小细胞肺癌的随机对照试验(RCT)前瞻性验证。但是,它们都有一些局限性。值得注意的是,患者高PD-L1表达有更好的预后[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,但PD-L1表达<1%的患者仍可受益于ici [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].此外,尽管PD-L1表达类似,但仍有一些患者对ICIs无反应[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].TMB是一个连续变量,其最佳截止值存在争议。利用基因图谱确定截断值的各种平台和标准并不统一[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].对于液体活检,PD-L1和TMB更令人不满意。治疗前PD- l1 +循环肿瘤细胞(CTCs)的患者在使用PD-(L)1抑制剂治疗后预后较差[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,而PD-L1表达则与组织中良好的预后相关。在橡树和杨树试验中[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba, bTMB≥16被认为是非小细胞肺癌ICIs的预测指标,但不是预后指标。在最近的一项研究中,bTMB≥6是ICIs治疗患者无进展生存(PFS)的预后生物标志物[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba],但它是否在预测总体生存率(OS)方面起作用仍不确定。gydF4y2Ba

除了PD-L1表达和TMB,最近的研究报道了特定的基因改变,如KRAS/TP53 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba), STK11 / LKB1 [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],EGFR [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba), POLD1 /极[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba], TET1 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba], EPHA [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba], KEAP1 [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba],以及NOTCH [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba],通过调节肿瘤免疫微环境(TIME)与ICIs反应相关,并作为预测ICIs预后的生物标志物。然而,它们只是预测性的,而不是预测性的,这意味着无法帮助选择受益于ICIs的患者。此外,如果他们的ctDNA突变也可以预测,但尚未得到验证,那么对更多的患者来说,这将更加方便和容易。gydF4y2Ba

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPRs)是一个跨膜免疫球蛋白家族,由20多个成员组成,共享同源磷酸酶结构域并沿细胞膜分布[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba].PTPRs通过去磷酸化靶蛋白,拮抗蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)的活性,参与信号转导、调节肿瘤发生和时间。以PTPRD为例,PTPRD失活诱导CXCL8促进胃癌血管生成和转移[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]PTPRD的缺失导致STAT3异常激活并促进胶质瘤的进展[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].PTPRD有害突变和缺失预测转移性大肠癌中贝伐单抗耐药性[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].胶质母细胞瘤中PTPRD的突变失活与黑色素瘤恶性肿瘤有关[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].其他PTPRs,包括PTPRA [gydF4y2Ba28gydF4y2Ba],PTPRC [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]和PTPRJ [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,也参与调节肿瘤的发生和时间。更重要的是,有报道称PTPRD与其配体LRFN4的相互作用与膀胱癌中ICIs的应答有关[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba但在非小细胞肺癌中尚不清楚。因此,我们假设PTPRs在响应非小细胞肺癌的ICIs中也具有可分配的功能。gydF4y2Ba

在这里,我们报道了组织和ctDNA PTPRD磷酸酶结构域突变作为预测ICIs更高的客观应答率(ORR)和有利的PFS的预后生物标志物。肿瘤组织中的PTPRD磷酸酶结构域突变预测OS,而ctDNA中的PTPRD磷酸酶结构域突变可作为一种预测生物标志物,帮助选择非鳞状NSCLC (ns-NSCLC)中ICIs获益的患者。PTPRD预测效果与TMB/PD-L1表达无关,可能与时间调控有关。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

发现队列中的患者gydF4y2Ba

73例接受抗pd -(L)1抗体治疗的NSCLC患者作为发现队列(也称为NCC队列)进行评估。这73例患者来自2016年12月至2018年12月国家肿瘤中心/国家肿瘤临床研究中心/肿瘤医院、中国医学科学院北京协和医学院和中山大学肿瘤中心。所有73例NSCLC患者都是临床试验的一部分。合格的患者的入选标准为本研究如下:(1)年龄≥18年,(2)东部合作肿瘤组(ECOG) 0 - 1的性能状态,(3)先进或复发性非小细胞肺癌病理验证,(4)一线铂基化疗失败后,和(5)根据RECIST v1.1放射检查可评价的。CT或MRI成像扫描由至少2名合格的研究人员独立评估。采用全外显子测序(WES)对患者肿瘤组织进行测序。本研究得到了所有参与中心伦理委员会的批准(NCC2016JZ-03和NCC2018-092)。73例患者均提供书面知情同意书。这73例患者的临床特征列于附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2BaS1:表。gydF4y2Ba

公共组gydF4y2Ba

本研究还使用了其他7个独立的公共队列,命名为N. Rizvi [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba],张春[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba],苗族[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba], mskcc - 240 [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba],NG1661 [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]、橡树和极地种群[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),分别。将NG1661组NSCLC患者分离命名为MSKCC-350组。这7个公共队列的数据来源于相应发表的文章。这7个公共队列和NCC队列的详细信息列于附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2BaS2:表。gydF4y2Ba

TCGA-LUAD和TCGA-LUSC队列的数据从cBioPortal下载[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

PTPRD突变gydF4y2Ba

非同义突变,包括帧内/帧移缺失/插入、无义、不间断、剪接区域、剪接位点和错义突变,在本研究中定义为PTPRD突变。蛋白质变异效应分析仪(PROVEAN)[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]来预测突变对PTPRD功能的影响。所有单氨基酸替换和帧内缺失/插入/插入-删除均使用PROVEAN进行分析。根据官方说明,突变被分为中性突变或有害突变,截止值为−2.5。关于每个突变的PROVEAN评分/预测的详细信息在附加文件中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S3。所有的无义、移码缺失/插入和剪接区域/位点突变也被定义为有害的,因为它们改变了整个后续氨基酸序列。将磷酸酶结构域的有害突变定义为phosphatase- mutt (p - mutt),将所有其他突变定义为other- mutt (o - mutt)。gydF4y2Ba

研究评估gydF4y2Ba

在NCC队列中,在首次抗pd -(L)1治疗后每6-8周评估一次应答,直到客观疾病进展。客观缓解率(ORR)定义为经RECIST V.1.1确认的完全缓解(CR)或部分缓解(PR)患者的百分比。PFS定义为从第一次治疗到病情进展或死亡的时间。截止2020年1月1日没有进展的患者被记录为审查。gydF4y2Ba

在7个公共队列中,根据每篇发表的文章195的描述评估了应答gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

TCGA-LUAD和TCGA-LUSC的RNA-seq数据用CIBERSORTx估计免疫细胞的浸润[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba或使用Java GSEA桌面应用程序(GSEA v4.0.1)进行基因集富集分析(GSEA) [gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].GSEA采用HALLMARK和KEGG基因集,其他设置均为默认设置。为了更好地了解PTPRD突变在调节TIME和ICIs反应中的作用,应用了免疫基因组管道[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].为了探讨PTPRD表达与免疫细胞浸润和富集途径的估计之间的关系,仅采用PTPRD- wt样本。gydF4y2Ba

统计分析和图表gydF4y2Ba

连续变量用Mann-Whitney进行比较gydF4y2BaUgydF4y2Ba测试。分类变量(如ORR和PD-L1状态)的显著性采用卡方检验或Fisher精确检验。将生存率与Kaplan-Meier曲线进行比较gydF4y2BapgydF4y2Ba通过对数秩检验计算值。采用单变量和多变量Cox回归确定风险比(HR)。变量与gydF4y2BapgydF4y2Ba单变量回归< 0.1纳入多变量Cox回归。所有分析都是通过GraphPad (v 8.0.3)或R (v 4.0.3)实现的。所有图形均使用GraphPad (v 8.0.3)或R (v 4.0.3)绘制。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

ICIs治疗NSCLC患者的工作流程和PTPR突变gydF4y2Ba

为了研究PTPRs在ICI治疗中的作用,我们使用了一个发现队列和3个验证队列(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).发现队列包括73例接受ICIs治疗的NSCLC患者的临床和WES数据。发现队列的患者特征列于附加文件中gydF4y2Ba1gydF4y2BaS1:表。验证队列1 (gydF4y2BangydF4y2Ba=377)由4个独立队列组成,详细的无进展生存期和对疗效的客观评价,N. Rizvi (gydF4y2BangydF4y2Ba= 34),张春(gydF4y2BangydF4y2Ba= 75),苗族(gydF4y2BangydF4y2Ba=56), MSKCC-240 (gydF4y2BangydF4y2Ba=240),并用于预测ORR和PFS。验证队列2 (gydF4y2BangydF4y2Ba=406)由2个独立队列组成,其中苗族(gydF4y2BangydF4y2Ba=56)和MSKCC-350 (gydF4y2BangydF4y2Ba=350)队列,并用于验证预测OS。验证队列3 (gydF4y2BangydF4y2Ba=1137)由2个独立队列组成,OAK (gydF4y2BangydF4y2Ba=850)和POPLAR (gydF4y2BangydF4y2Ba=287)的队列,并用于验证ctDNA的预测效果。本研究的工作流程如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

ICIs治疗NSCLC患者的工作流程和PTPR改变。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba本研究的工作流程。gydF4y2BabgydF4y2Ba多队列的PTPR突变景观gydF4y2Ba

在NCC、Hellmann、Miao和N. Rizvi队列(均由WES测序)中,所有的PTPRs都发生了突变,范围从0.4% (PTPRA、PTPRE、PTPRs)到10% (PTPRD)(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Bab上半部分)。在MSKCC-240/350中(均由IMPACT小组测序,且有部分常见患者),PTPRD、PTPRS和PTPRD被纳入小组,突变率分别为13%、2%和10%(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba中间面板)。在OAK和POPLAR队列中(两者都由Foundation One进行了排序)gydF4y2BaTMgydF4y2Ba基于ctDNA),只有PTPRD被测序,突变率为9%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba下半部分)。gydF4y2Ba

组织PTPRD突变是nsclc中ICIs的预后标志物gydF4y2Ba

我们首先调查了发现队列中非小细胞肺癌PFS中PTPR突变的危险比(HRs),发现PTPRB (HR=0.43,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0432), PTPRD (HR = 0.44,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0178),和PTPRN2(HR = 0.30,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0499)突变与PFS较长相关,而PTPRC突变与PFS较短相关(HR=181.9,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0032)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Baa) 。在所有PTPR中突变率最高,这意味着适用于更多患者,因此选择PTPRD进行进一步研究。PFS的PTPRD突变与野生型(WT)的K-M绘图仪(324对63天,HR=0.38,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0169),如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab.考虑到非鳞癌和鳞癌ICIs反应的异质性,将NSCLC患者分为非鳞癌和鳞癌亚组。在非鳞NSCLC (ns-NSCLC)中,PTPRD突变患者的PFS中位也更长(324天vs 63天,HR=0.36,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0152,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bac) 鳞状细胞亚组中未发现PTPRD突变。在所有NSCLC患者中,PTPRD突变组的客观缓解率(ORR)高于WT组(68%对15%),gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bad),在nsclc亚组中结果一致(68% vs 14%,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
figure2gydF4y2Ba

组织PTPRD突变预测ICIs在非鳞NSCLC中的有效性。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba发现队列中PFS PTPR突变的HR森林图gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2Ba非小细胞肺癌无进展生存期(gydF4y2BabgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BacgydF4y2Ba)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba非小细胞肺癌的客观反应(gydF4y2BadgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BaegydF4y2Ba)。gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2BaggydF4y2Ba非小细胞肺癌无进展生存期(gydF4y2BafgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BaggydF4y2Ba)。gydF4y2BahgydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba非小细胞肺癌的ORR (gydF4y2BahgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)验证队列1。gydF4y2BajgydF4y2Ba,gydF4y2BakgydF4y2Ba非小细胞肺癌的总体生存(gydF4y2BajgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BakgydF4y2Ba)在验证队列2gydF4y2Ba

接下来,我们在验证队列1中验证了PTPRD突变与PFS/ORR之间的关联。在所有NSCLC患者中,PTPRD突变患者的中位PFS更长(7.95 vs 4.37个月,HR=0.69,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.047,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Baf), nsclc也有类似的结果(9.10 vs 4.33个月,HR=0.62,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0184,图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bag)。然而,在鳞状细胞亚组中没有发现一致的趋势(8.38 vs 4.27个月,HR=1.30,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.72,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1a)。在两种NSCLC中,PTPRD突变患者均观察到有利的ORR (67% vs 29%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.011,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bah)和nsclc亚组(69% vs 28%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.013,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一世)。gydF4y2Ba

在验证队列2中,PTPRD突变的NSCLC患者中位OS更长(超过40.00个月vs 11.00个月,HR=0.57,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0112,图gydF4y2Ba2gydF4y2Baj). nsclc的结果相似(超过40个月vs 11.94个月,HR=0.40,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0007,无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Bak)。在鳞状细胞亚组,观察到相反的趋势(6.00 vs 11.00个月,HR=3.24,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0073,附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图印地)。gydF4y2Ba

验证队列1和验证队列2中的5个独立队列中PTPRD突变预测PFS/OS的详细信息见补充资料(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1c-d、图S2、图S3)。gydF4y2Ba

总体而言,在接受ICIs治疗的非鳞但非鳞肺癌患者中,组织PTPRD突变预示着更长的PFS/OS和更高的ORR。gydF4y2Ba

ctDNA PTPRD突变是ns-NSCLC ICIs的预后生物标志物gydF4y2Ba

验证组3,用于测试是否ctDNA PTPRD突变的预测效率符合组织PTPRD突变,有一个趋势,平均PFS ctDNA PTPRD突变的时间比WT组在非小细胞肺癌,尽管不是统计学意义(6.36 vs 2.36个月,HR = 0.71,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0603,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).在nsclc中,ctDNA PTPRD突变的中位PFS比WT组长(6.97 vs 2.73个月,HR=0.63,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0282,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab).这两个独立队列的详细资料见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4a-d。在鳞状细胞亚组中,PTPRD突变组和WT突变组的中位PFS无差异(2.00 vs 2.86个月,HR=1.28,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.49,附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1e)。这两个独立队列的详细资料见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1f-g。此外,对于NSCLC患者,突变组的ORR与WT组无差异(28% vs 15%,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0796,图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac).而在nsclc中,突变组的ORR高于WT组(32% vs 15%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.047,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

ctDNA PTPRD突变预测ICIs在nsclc中的有效性。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba非小细胞肺癌无进展生存期(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BabgydF4y2Ba)在验证队列3。gydF4y2BacgydF4y2Ba,gydF4y2BadgydF4y2Ba非小细胞肺癌的客观反应(gydF4y2BacgydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BadgydF4y2Ba)。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2Ba非小细胞肺癌的总体生存(gydF4y2BaegydF4y2Ba)或nsclc (gydF4y2BafgydF4y2Ba)在验证队列3gydF4y2Ba

在NSCLC中,PTPRD突变和野生型之间的中位OS差异无统计学意义(16.6 vs 13.2个月,HR=0.92,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.670,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae), nsclc (17.3 vs 15.2个月,HR=0.90,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.662,无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baf)或鳞状上皮亚组(8.90 vs 8.48个月,HR=1.29,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.619,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1h)。在2个个体队列中也观察到类似的结果(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S4e-h,图S1i-j)。gydF4y2Ba

综上所述,在接受ICIs治疗的nsclc患者中,ctDNA PTPRD突变也可以预测更长的PFS和更高的ORR,而不是OS。gydF4y2Ba

PTPRD的磷酸酶突变可作为预后生物标志物gydF4y2Ba

我们随后总结了PTPRD突变位点的分布,发现突变位点呈弥漫性,没有明显的热点突变(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).为了评估特定的单个突变对PTPRD生物学功能的影响,我们使用在线工具PROVEAN预测每个突变的影响(见“方法”部分)。考虑到PTPRD的不同结构域具有各自的功能,且PTPRD主要通过其磷酸酶结构域作为一种磷酸酶发挥作用,我们根据中性或有害的位置(磷酸酶或其他结构域)综合定义了两组突变组:phosphatase-mut和other-mut。磷酸酶域的有害突变被定义为磷酸酶突变(P-mut)。其他突变定义为other-mut (O-mut)。有趣的是,磷酸酶域没有中性突变(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa).接下来我们分析这两个突变组预测效率的差异。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
图4.gydF4y2Ba

PTPRD的磷酸酶突变可作为预后的生物标志物。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaPTPRD突变的分布和突变类型(有害/中性)和位点(磷酸酶/其他结构域)的重叠。gydF4y2BabgydF4y2Ba,gydF4y2BacgydF4y2BaPFS (gydF4y2BabgydF4y2Ba)及or (gydF4y2BacgydF4y2Ba)。gydF4y2BadgydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2BaPFS (gydF4y2BadgydF4y2Ba)及or (gydF4y2BaegydF4y2Ba),验证队列1。gydF4y2BafgydF4y2Ba验证队列2中不同组的OS。gydF4y2BaggydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2BaPFS (gydF4y2BaggydF4y2Ba),或者(gydF4y2BahgydF4y2Ba)和操作系统(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)在验证队列3中gydF4y2Ba

在发现队列的nsclc中,磷酸酶mut的中位PFS比WT更长(503.5天vs 63.00天,HR=0.26,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0066,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)或其他mut (503.5 vs 132天,HR=0.18,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0177,请参见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S5a)。其他mut患者的中位PFS与WT患者无显著差异(132 vs 63 d, HR=1.01,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.99,附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba中:图S5b中)。磷酸酶-MUT的ORR比WT高(75%对14%,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac). other-mut与WT或磷酸酶-mut的ORR差异不显著(两者均无显著性差异)gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bac)。gydF4y2Ba

在验证队列-1的nsclc中,磷酸酶-mut的中位PFS比WT长(10.39 vs 4.33个月,HR=0.54,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0213,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bad). other-mut与磷酸酶mut的差异(HR=0.69,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.3288,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图sfc)或WT无显著性差异(HR=0.75,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.3267,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba中:图S5D)。磷酸酶-MUT的ORR比WT高(71%对28%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.035,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae). other-mut与WT或磷酸酶-mut的ORR差异不显著(两者均无显著性差异)gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

在验证队列2的nsclc中,磷酸酶-mut的中位OS比WT长(超过40.00个月vs 11.94个月,HR=0.27,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0015,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Baf).磷酸酶-mut和其他-mut之间的差异(超过40个月vs 19.00个月,HR=0.40,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0818,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图s2e)或其他mut和WT没有显著性差异(19.00 vs 11.94个月,HR=0.65,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.1769,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S5f)。gydF4y2Ba

在验证队列3的nsclc中,磷酸酶-mut的中位无进展生存期(PFS)长于WT (10.78 vs 2.73个月,HR=0.40,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0106,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bag).磷酸酶-mut与其他-mut之间的差异(10.48 vs 5.75个月,HR=0.51,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.1175,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S5g)或其他mut和WT没有显著性差异(5.75 vs 2.73个月,HR=0.85,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.4988,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S5h)。磷酸酶mut的ORR高于WT (58% vs 15%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0002,图gydF4y2Ba4gydF4y2Bah).与其他mut相比,WT的ORR更高(15% vs 12%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.021,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah). others -mut和磷酸酶-mut之间的差异无统计学意义(58% vs 12%,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.804,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Bah)。磷酸酶-mut和WT之间的中位OS无显著性差异(超过24.09 vs 15.18个月,HR=0.52,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.1422,无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba一世)。过24.09 VS16.59个月磷酸-MUT和其他-MUT(之间的差,HR = 0.46,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.1225,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图ssi)或其他突变和WT无显著性差异(16.59 vs 15.18个月,HR=0.82,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.4825,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S5j)。gydF4y2Ba

PTPRD磷酸酶突变预测每个组织或ctDNA队列中ICIs的PFS/OS的详细信息见附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S6(组织队列)和图S7 (ctDNA队列)。gydF4y2Ba

提示PTPRD磷酸酶mutt可以预测ICIs的PFS、OS和ORR,而其他mutt不能。gydF4y2Ba

ctDNA PTPRD磷酸酶mutt是nsclc中ICIs的预测生物标志物gydF4y2Ba

为了研究PTPRD磷酸酶-mut是否是选择ICIs (Atezolizumab)比化疗(多西他赛)获益更多的患者的预测生物标志物,我们首先在几个亚组中研究PTPRD磷酸酶-mut是否是PFS的预测生物标志物(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa). PTPRD WT不是Atezolizumab的预测性生物标志物(gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).突变亚组中,Atezolizumab和docetaxel的中位PFS为6.97 vs 3.11个月(HR=0.48,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.03,gydF4y2BaPgydF4y2Ba交互价值= 0.09);在其他亚组中,Atezolizumab和docetaxel的中位无进展生存期(PFS)为6.36 vs 1.84个月(HR=0.52,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.12);在磷酸酶mut亚组中,Atezolizumab和docetaxel的中位PFS为10.48 vs 4.17个月(HR= 0.38,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.10,gydF4y2BapgydF4y2Ba值= 0.0506)进行交互。此外,在鳞癌亚组中,PTPRD突变不是ICIs的生物标志物(中位PFS: 3.29 vs 2.00个月,HR=0.96,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.93)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
图5.gydF4y2Ba

ctDNA PTPRD磷酸酶mutt是nsclc中ICIs的预测生物标志物。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2BaPFS (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)及操作系统(gydF4y2BabgydF4y2Ba)验证队列3中Atezolizumab在不同亚组的HR森林图。*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.01;***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;****gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001gydF4y2Ba

我们进一步研究了PTPRD在Atezolizumab和多西他赛之间预测OS的作用(图)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)。的NS-NSCLC组(中位OS:15.47 VS11.24个月,HR = 0.71,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0002), WT组(中位OS: 15.18 vs 11.53个月,HR=0.74,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.001),所有突变基(中位OS:17.31 VS7.8个月,HR = 0.42,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0176)和磷酸酶mut亚组(中位OS: 24.04 vs 9.69个月,HR=0.16,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0273),但在其他mut亚组中没有(中位OS: 16.59 vs 6.24个月,HR=0.57,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.368), Atezolizumab的中位OS较多西他赛长(图3)。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB)。的gydF4y2BapgydF4y2BaWT/all突变或WT/磷酸酶mut与Atezolizumab/docetaxel的相互作用值分别为0.66和0.04。在鳞状细胞癌突变亚组中,Atezolizumab与docetaxel的OS无差异(中位OS: 10.92 vs 8.87个月,HR=0.98,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.97)。gydF4y2Ba

总之,我们的研究结果表明,PTPRD磷酸酶mut是一种预测生物标志物,可以预测Atezolizumab或多西紫杉醇治疗患者的PFS/OS。gydF4y2Ba

PTPRD的预测效果与TMB或PD-L1表达无关gydF4y2Ba

考虑到TMB和PD-L1表达是两种广泛应用于ICIs的生物标志物,我们检测PTPRD的预测是否依赖于它们。计算比较PTPRD WT组、其他mut组、磷酸酶mut组TMB和PD-L1表达的差异。在发现队列中,磷酸酶mut的TMB高于WT (24.48 vs 6.18,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa) 。WT和其他mut或磷酸酶mut和其他mut(两者)之间没有差异gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).在验证队列1中,WT的TMB低于磷酸酶mut (7.93 vs 24.90,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)和other-mut (7.93 vs 17.11,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB),而其他-mut和磷酸酶mut之间没有差异(17.11 vs 24.90,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.179,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab).在验证队列2中,磷酸酶mut的TMB高于其他mut (30.13 vs 16.00,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.015,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)和WT (30.13 vs 7.597,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac). others -mut的TMB也高于WT (16.00 vs 7.597,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bac).在验证队列3中,WT的TMB低于others -mut (9.76 vs 24.8,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaD)和磷酸酶mut (9.76 vs 28.7,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad). others -mut和phosphatase-mut的TMB无差异(24.8 vs 28.7,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.40,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bad).在TCGA-LUAD队列中,WT的TMB低于其他mut (6.24 vs 11.49,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2BaE)和磷酸酶mut (6.24 vs 19.79,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae). others -mut和phosphatase-mut的TMB无差异(11.49 vs 19.79,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.218,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Bae)。gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
figure6gydF4y2Ba

PTPRD突变与TMB、PD-L1表达的关系。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaegydF4y2Ba发现队列中WT、other-mut、磷酸酶mut组的TMB (gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)、验证队列1 (gydF4y2BabgydF4y2Ba),验证队列2 (gydF4y2BacgydF4y2Ba),验证队列3 (gydF4y2BadgydF4y2Ba)和TCGA-LUAD队列(gydF4y2BaegydF4y2Ba).gydF4y2BafgydF4y2Ba,gydF4y2Ba我gydF4y2Ba发现队列中WT、other-mut和磷酸酶-mut组的PD-L1表达(gydF4y2BafgydF4y2Ba)、验证队列1 (gydF4y2BaggydF4y2Ba),验证队列3 (gydF4y2BahgydF4y2Ba)和TCGA-LUAD队列(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba).gydF4y2BajgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BalgydF4y2Ba发现与验证队列1的单变量和多变量cox回归分析森林图(gydF4y2BajgydF4y2Ba),验证队列3 (gydF4y2BakgydF4y2Ba),验证队列2 (gydF4y2BalgydF4y2Ba).*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.01;***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;****gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;n。,没有意义gydF4y2Ba

我们还调查是否有PTPRD突变和PD-L1的表达之间的任何关联。在发现队列中,验证群体1和验证队列3,没有差别在PTPRD WT,其他-MUT,和磷酸-MUT组间PD-L1表达被发现(所有gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Baf-h)。在TCGA-LUAD队列中,PD-L1 mRNA在PTPRD WT组、其他mut组和磷酸酶mut组中表达相似(所有组)gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba一世)。gydF4y2Ba

考虑到WT和磷酸酶mut在TMB上的差异,我们在这些队列的单变量和多变量Cox回归分析中讨论了磷酸酶mut是否是一个独立的生物标志物。由于发现队列病例数量有限(49例nsclc),因此将其与验证队列1结合以提高检测效率。在合并队列中,PTPRD磷酸酶mut (HR=0.26 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0002);HR = 0.30 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.01);gydF4y2Ba6gydF4y2Baj),而其他-mut (HR=0.74,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.27,图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baj),是预测ICIs PFS的独立生物标志物。在验证队列3中,PTPRD磷酸酶mut是预测ICIs PFS的独立生物标志物(HR=0.30 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.008);HR = 0.31 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.009);gydF4y2Ba6gydF4y2Bak),而others -mut则没有(HR=0.85,gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.50,图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bak).在验证队列2中,磷酸酶-mut也是预测ICIs OS的依赖生物标志物(HR=0.48 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.004);HR = 0.59 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.046)的多元分析,图。gydF4y2Ba6gydF4y2Bal),而others -mut则没有(HR=0.64,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.18在单变量分析中,图gydF4y2Ba6gydF4y2Bal)。gydF4y2Ba

我们的数据表明,尽管PTPRD与TMB相关,但PTPRD磷酸酶mutt是一个独立于TMB或PD-L1表达的ICIs的预测效率的生物标志物。gydF4y2Ba

PTPRD磷酸酶突变的预测效率与TP53/EGFR/KRAS突变无关gydF4y2Ba

为了验证PTPRD磷酸酶突变的预测效率是否独立于其他基因突变,包括TP53、EGFR、KRAS、STK11和KEAP1,我们检测了PTPRD是否与这些基因共突变或单独突变。在NGS队列(Hellmann, Miao, N.Rizvi和NCC队列)中,PTPRD和这些基因之间既没有共突变,也没有单独突变gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8a)。在由IMPACT panel测序的MSKCC-240和MSKCC-350队列中,PTPRD与TP53共突变(gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05),但不与其他基因(所有gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8b)。在Foundation One测序的OAK/POPLAR队列中,PTPRD与TP53共突变(gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05),但不与其他基因(所有gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8c)。在WES测序的TCGA-LUAD队列中,PTPRD与这些基因之间既没有共突变,也没有专属突变(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8d)。gydF4y2Ba

由于TP53与PTPRD、EGFR和KRAS是肺腺癌中常见的两种突变,并且对ICIs的应答有很大的影响,我们计算了不同队列中TP53/EGFR/KRAS突变/WT亚组中PTPRD磷酸酶突变的预测效率。在发现队列中,TP53 WT和EGFR突变亚组中未发现PTPRD磷酸酶突变。在WT KRAS亚组中(HR=0.21,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0078,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8e),但没有突变KRAS亚组(HR=0.72,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.75,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8e),磷酸酶mut是PFS的生物标志物,但是gydF4y2BapgydF4y2Ba交互的值为0.25(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8e)。对于验证队列1,在EGFR-WT和KRAS-WT亚组中,而在其他亚组中,PTPRD磷酸酶mut是PFS的一个生物标志物(HR=0.52 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.04), HR=0.47 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.01),分别,附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8f)。而gydF4y2BapgydF4y2Ba各基因的相互作用分别为0.5、0.91和0.15(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8f)。关于验证队列2,在TP53-MUT,EGFR-WT和KRAS-WT亚组,而不是在其他子组,PTPRD磷酸酶MUT是为OS(HR = 0.42的生物标志物(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0034), HR = 0.48 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.01), HR=0.40 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0063),附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8g)。而gydF4y2BapgydF4y2Ba各基因的交互作用值分别为0.79、0.99和0.28(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8g)。在验证队列3中,在EGFR mut和KRAS mut亚组中未发现PTPRD磷酸酶mut。PTPRD磷酸酶mut是PFS的生物标记物(HR=0.31)(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.04), HR = 0.30 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.03), HR = 0.31 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0049), HR = 0.30 (gydF4y2BapgydF4y2Ba=0.0046),附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图8),但不是OS(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8i)在TP53-WT和突变亚群中。的gydF4y2BapgydF4y2BaPFS-HR的PTPRD磷酸酶-mut和TP53突变/WT相互作用值为0.914gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图8)和OS-HR的0.515(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S8i)。gydF4y2Ba

总之,尽管在MSKCC-240、MSKCC-359和OAK/POPLAR队列中,PTPRD与TP53共突变,但PTPRD磷酸酶突变的预测效率与TP53/EGFR/KRAS突变无关。gydF4y2Ba

生物信息学分析揭示PTPRD调控肿瘤免疫微环境的潜在机制gydF4y2Ba

肿瘤免疫微环境(TIME)是ICI抗肿瘤效果的基础。为了揭示PTPRD预测的潜在生物学过程,我们重点研究了PTPRD是否和如何调节时间。首先,我们估计了CIBERSORTx在TCGA-LUAD队列中浸润的22种免疫细胞,包括CD8+ T细胞、调节性T细胞(Tregs)和2型巨噬细胞。与WT相比,PTPRD磷酸酶mutt样本有更多的浆细胞和记忆激活的CD4 T细胞和CD8+ T细胞(全部)gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个,左面板)。其他-MUT样品具有更少的存储器静息CD4 + T细胞中比WT(gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个,左面板)。在免疫细胞浸润方面,磷酸酶-mut与其他mut样本无明显差异gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个,左面板)。我们还通过PTPRD表达估计了22种免疫细胞的浸润情况。与ptprd低表达组(<中位表达)相比,ptprd高表达组(≥中位表达)血浆细胞、CD8+ T细胞、记忆活化CD4+ T细胞、滤泡辅助性T细胞和treg细胞较少,NK细胞、记忆B细胞和M2巨噬细胞活性较多(均为阴性)gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba右面板)。gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
figure7gydF4y2Ba

PTPRD调节肿瘤免疫微环境的机制。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba估测22个免疫细胞的PTPRD WT、磷酸酶mutt和其他mutt(左图)或PTPRD低和高(右图)的浸润情况。gydF4y2BabgydF4y2BaHeatmap描述了免疫相关基因在PTPRD突变类型(FC1: other-mut/WT, FC2: phosphatase-mut/WT, FC3: phosphatase-mut/other-mut)中表达水平的对数倍变化。蓝色表示下调,红色表示上调。gydF4y2BacgydF4y2BaTCGA-LUAD中PTPRD跨PTPRD突变的表达。gydF4y2BadgydF4y2Ba比较PTPRD低和高的GSEA富集。gydF4y2BaegydF4y2Ba,gydF4y2BafgydF4y2BaPTPRD与免疫检查点信号基因的相关性(gydF4y2BaegydF4y2Ba)、T效应和IFN-γ基因标记(gydF4y2BafgydF4y2Ba).*gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05;**gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.01;***gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001;****gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001gydF4y2Ba

其次,为了发现PTPRD突变如何调节重要的免疫分子,应用了免疫基因组管道[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].PTPRD WT、phosphatase- mutt和other- mutt的折叠变化在热图中显示(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab、 FC1:其他mut/WT,FC2:磷酸酶mut/WT,FC3:磷酸酶mut/其他mut)。与WT或其他mut相比,磷酸酶mut样本具有更多HLA、共刺激因子、刺激配体和受体、细胞粘附和其他分子的表达,尽管一些共抑制剂也升高。gydF4y2Ba

我们未能找到基因集富集分析(GSEA)不同富集途径或PTPRD WT之间的免疫检查点的签名和T效应和IFN-γ基因特征的不同表达模式/磷酸-MUT /在TCGA-其他-MUT亚组LUAD队列。这个原因可以归因于在TCGA-LUAD有限突变例(12磷酸-MUT例和其他21-MUT例)。gydF4y2Ba

考虑到PTPRD磷酸酶有降低mRNA表达的趋势(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Bac),这对PTPRD的生物学功能也很重要,我们试图揭示PTPRD表达的富集途径,以及PTPRD表达与免疫检查点标记、t效应和IFN-γ基因标记之间的相关性。GSEA显示,在ptprd高组中,KEGG库中的TGF-β信号、WNT信号、VEGF信号、JAK_STAT信号、MAPK信号、toll样受体信号以及HALLMARK库中的上皮-间质转化信号、IL-6_JAK信号、NOTCH信号、TGF-β信号均富集(所有NES≤1.5,归一化)gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,富兰克林·德兰诺·罗斯福gydF4y2Ba问gydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Bad). PTPRD与CTLA4、TIM3、ICOS、OX40、PD-L1、PD-L2、VTCN1和TIGIT等多个免疫检测点标记基因相关(均为阳性)gydF4y2BaRgydF4y2Ba> 0,gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Bae),并与IFN-γ基因特征的部分基因(包括IFI16、IRF1、STAT1、PSMB9、GZMB、IFN-γ、CXCL9、CXCL10)呈负相关(均)gydF4y2BaRgydF4y2Ba< 0,gydF4y2BapgydF4y2Ba<0.05,图gydF4y2Ba7gydF4y2Baf)。gydF4y2Ba

以上数据提示,磷酸酶mutt组抗肿瘤免疫细胞数量较多,且具有“热”时间。更高的PTPRD表达与更少的抗肿瘤、更多的促肿瘤免疫细胞有关。此外,PTPRD与免疫检查点信号正相关,与t效应和IFN-γ基因信号负相关。gydF4y2Ba

应用GSEA分析TCGA-LUSC队列中PTPRD调控的潜在下游通路。富集的途径谱,包括UV反应和Hedgehog信号通路,与TCGA-LUAD队列完全不同。在TCGA-LUSC队列中,那些被报道与ICIs应答密切相关的信号通路,包括TGF-β信号通路、IFN-γ信号通路和WNT信号通路,在ptprd高组中均不富集(Additional file)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S4)。富集途径的差异可能有助于解释为什么PTPRD突变不能作为鳞状肺癌ICIs的生物标志物。gydF4y2Ba

PTPRD不是接受手术和辅助化疗的nsclc的预后生物标志物gydF4y2Ba

我们的数据显示PTPRD磷酸酶突变不是化疗的预后生物标志物(gydF4y2BapgydF4y2Ba互动< 0.05,无花果。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).我们随后分析了TCGA-LUAD队列中接受手术加(neo)辅助化疗的患者的无病生存(DFS)/OS。PTPRD突变、磷酸酶突变和PTPRD mRNA表达均不能预测DFSgydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S9a-c)。在OS中观察到类似的结果(所有gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S9d-f)。gydF4y2Ba

综上所述,PTPRD突变/表达不是非鳞肺癌化疗和手术的预后生物标志物。gydF4y2Ba

预测PTPRD突变在其他癌症类型中的预后效率gydF4y2Ba

基于一项公共队列研究,我们分析了PTPRD突变在结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌、食管癌、黑色素瘤和未知原发癌等其他癌症类型中的预测效率。对于黑色素瘤患者,PTPRD突变组的中位OS比WT更长(超过80个月vs 41.00个月,HR=0.55,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0215,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S10a)。对于膀胱癌患者,PTPRD突变组的中位PFS与WT无差异(超过33.00个月vs 16.00个月,HR=0.29,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.062,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S10b)。对于其他患者(食管癌、胃癌、膀胱癌、头颈癌、结直肠癌、原发不明),PTPRD突变组的中位PFS与WT无明显差异(均为p > 0.05)gydF4y2BapgydF4y2Ba≥0.05,额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S10c-f)。gydF4y2Ba

总的来说,PTPRD突变也可以预测具有ICIs的黑色素瘤患者的OS,但仍需要更多的验证。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

据我们所知,ICIs的理想生物标志物应该是既能预测预后又能预测预后,这意味着既能预测ICIs的结果(包括ORR、PFS和OS),又能帮助选择从ICIs中受益更多的患者[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].PD-L1表达和TMB目前尚不令人满意。PD-L1表达<1%的患者也可受益于ICIs [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba, bTMB≥16具有预测作用,但无预后[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].此外,PD-L1表达和TMB均为连续变量,没有明确的截止点[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,不同的检测平台和方法也有很大差异[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba].因此,除了PD-L1和TMB外,还迫切需要其他生物标志物。gydF4y2Ba

与PD-L1表达和TMB相比,下一代测序方法更容易检测到特定的基因突变,并容易将其分为突变型和野生型。这些生物标志物,如TP53/KRAS [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba], STK11 [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),钢管/ POLD1 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]及环境卫生及环境影响局[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]突变,是有希望的,但他们并不都预后和预测。此外,它们中的一些在叶绿体DNA,克服组织活检过程中由于肿瘤的异质性误差和是非侵入性的并且易于动态地跟踪未验证。组织和叶绿体DNA的生物标志物都预后和预测以及适用的预期。gydF4y2Ba

在此,我们发现PTPRD磷酸酶mutt在发现队列中可以预测ORR和PFS的结果,并在3个合并队列中验证gydF4y2BangydF4y2Ba=1920)组织或ctDNA PTPRD磷酸酶mut可以预测非鳞状NSCLC中ICIs的ORR、PFS和OS,尽管它不能预测验证队列3中的OS。这可以用ctDNA PTPRD突变和OS之间的双重关联来解释。我们最近的研究报道,虽然较高的bTMB与较高的ORR和较长的PFS相关,但它也与较高的最大体细胞等位基因频率相关,表明较高的肿瘤负担,因此与较短的OS相关[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba].因此,bTMB与OS之间的最终相关性并不显著。在我们的研究中,PTPRD磷酸酶mutt检测以足够的ctDNA为前提,这是基于较高的肿瘤负荷。因此,在本例中,ctDNA PTPRD突变与OS不良相关。另一方面,ICIs治疗ctDNA PTPRD突变患者可受益于ICIs, OS较好。综上所述,ctDNA PTPRD突变对OS的整体影响是双重的,没有统计学意义。此外,PTPRD磷酸酶mutt也是选择ICIs比化疗获益更多的患者的预测生物标志物。重要的是,上述预测在组织和ctDNA测序中都具有液体活检的优势,包括无创、重复性、更高的可达性、减少肿瘤异质性导致的偏差,并适用于更晚期的患者。上述所有PTPRD磷酸酶突变预测均与TMB、PD-L1表达或TP53/KRAS/EGFR突变无关。PTPRD突变与TMB/PD-L1表达结合是否会带来更高的效率,值得进一步研究。 Moreover, variant interpreters were more over single tools but not reflections of real influences, plasmid containing specific alteration was suggested to transfected into lung cancer cells to validate the predictions of specific mutations’ effects on PTPRD biological functions.

为了解释为什么PTPRD突变与有利的ICIs结果相关,一个潜在的潜在机制可能是PTPRD调节TGF-β通路和免疫检查站分子、T效应子和IFN-γ效应子,最终通过其磷酸酶活性影响CD8+ T细胞浸润,使TIME“热”。本研究为PTPRD与TIME的关系提供了新的线索,但其具体机制仍有待分子生物学实验验证。gydF4y2Ba

我们还发现,在接受ICIs治疗的黑色素瘤患者中,PTPRD与OS有关,在膀胱癌患者中,也存在这样的趋势(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.062)。与我们的发现一致的是,最近的一项研究报告称,PTPRD (WT)与其配体LRFN4的相互作用与膀胱癌中Atezolizumab应答不良有关[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].因此,PTPRD突变是否为ICIs的泛癌生物标志物值得进一步研究。此外,将组织或ctDNA PTPRD磷酸酶突变作为生物标志物的前瞻性试验值得在NSCLC和其他癌症类型中进行。我们计划在即将进行的多项PD-(L)1抗体在多种癌症类型中的随机II/III期研究中前瞻性地验证这些发现。gydF4y2Ba

这项研究有几个局限性。首先,它是基于我们自己的队列和7个公共队列的回顾性分析。要求进行前瞻性研究以进一步验证。其次,存在一定程度的研究异质性。不同的队列使用不同的策略,如抗PD-(L)的单一疗法1或与抗CTLA-4联合使用。PTPRD在不同药物中的预测效率需要进一步研究。第三,分子生物学实验仍有必要验证特定PTPRD突变如何影响免疫相关途径。最后但并非最不重要的是,ctDNA PTPRD突变是否与组织一致尚不清楚在我们之前的研究中,我们已经证明ctDNA EGFR突变与组织EGFR突变是一致的(尽管不是完全一致的),并且可以预测对EGFR TKI的反应结果[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba].因此,像EGFR突变一样,ctDNA PTPRD突变也被认为与组织突变一致。在我们目前的研究中,在组织和ctDNA队列中,突变频率相似(均约为10%),而且在组织和ctDNA队列中,PTPRD突变与PFS和ORR相关;因此推断ctDNA中PTPRD突变与肿瘤组织一致。然而,配对的组织和ctDNA样本有望在未来进行测序以验证这一点。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

总之,我们的研究表明,组织和ctDNA PTPRD磷酸酶mutt都可以作为预测ORR和PFS的预后生物标志物。组织PTPRD磷酸酶mutt也是OS的预后生物标志物。此外,PTPRD磷酸酶mutt也可以在ICIs和化疗中选择受益患者。需要进一步的前瞻性试验。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

本研究中使用的验证队列(包括N.Rizvi队列、Hellmann队列、Miao队列、MSKCC-240和NG1661队列)在“方法”部分公开。由于机构规定,本研究NCC队列的个体层面测序和详细临床数据无法上传到公共资源库,但可通过通讯作者合理请求获取。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

受到重罚。gydF4y2Ba

血液肿瘤突变负荷gydF4y2Ba

基因拷贝数异变:gydF4y2Ba

拷贝数变异gydF4y2Ba

克雷格:gydF4y2Ba

完整的反应gydF4y2Ba

CTC:gydF4y2Ba

循环肿瘤细胞gydF4y2Ba

叶绿体DNA:gydF4y2Ba

循环肿瘤脱氧核糖核酸gydF4y2Ba

CXCL8:gydF4y2Ba

C-X-C motif趋化因子配体8gydF4y2Ba

ECOG:gydF4y2Ba

东部肿瘤合作组织gydF4y2Ba

表皮生长因子受体:gydF4y2Ba

表皮生长因子受体gydF4y2Ba

GSEA:gydF4y2Ba

基因集富集分析gydF4y2Ba

人力资源:gydF4y2Ba

风险比gydF4y2Ba

艾多酷:gydF4y2Ba

免疫抑制剂检查站gydF4y2Ba

干扰素-γ:gydF4y2Ba

干扰素-γgydF4y2Ba

LUAD:gydF4y2Ba

肺腺癌gydF4y2Ba

LUSC:gydF4y2Ba

肺鳞癌gydF4y2Ba

非小细胞肺癌:gydF4y2Ba

非小细胞肺癌gydF4y2Ba

或者:gydF4y2Ba

客观缓解率gydF4y2Ba

操作系统:gydF4y2Ba

整体的生存gydF4y2Ba

帕金森病:gydF4y2Ba

进步的疾病gydF4y2Ba

PD-1:gydF4y2Ba

程序死1gydF4y2Ba

PD-L1:gydF4y2Ba

编写死亡配体1gydF4y2Ba

PFS:gydF4y2Ba

无进展生存gydF4y2Ba

公关:gydF4y2Ba

部分响应gydF4y2Ba

ptk:gydF4y2Ba

蛋白质酪氨酸激酶gydF4y2Ba

PTPRA:gydF4y2Ba

A型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体gydF4y2Ba

PTPRC:gydF4y2Ba

C型蛋白质酪氨酸磷酸酶受体gydF4y2Ba

PTPRD:gydF4y2Ba

蛋白质酪氨酸磷酸酶受体D型gydF4y2Ba

PTPRJ:gydF4y2Ba

蛋白酪氨酸磷酸酶受体J型gydF4y2Ba

PTPRs:gydF4y2Ba

蛋白质酪氨酸磷酸酶受体类型gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

稳定的疾病gydF4y2Ba

TCGA:gydF4y2Ba

癌症基因组图谱gydF4y2Ba

识别:gydF4y2Ba

T细胞抗原受体gydF4y2Ba

TGF -β:gydF4y2Ba

转化生长因子βgydF4y2Ba

尖:gydF4y2Ba

肿瘤浸润的淋巴细胞gydF4y2Ba

时间:gydF4y2Ba

肿瘤免疫微环境gydF4y2Ba

tTMB:gydF4y2Ba

组织肿瘤突变负荷gydF4y2Ba

韦斯:gydF4y2Ba

全外显子测序gydF4y2Ba

WT:gydF4y2Ba

野生型gydF4y2Ba

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下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

感谢患者捐赠标本,感谢本研究分析的7个公开ICI治疗队列和TCGA LUAD队列的所有贡献者的慷慨分享。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2019YFC1315700);国家自然科学基金重点项目(no . 81630071);国家自然科学基金面上项目(no . 81871889, no . 81972905);gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

所有作者同意提交此手稿。j.w., h.b., L. Z.和Y. S.设计了这个调查。y.s., j.d.和W.F.收集并整理了数据。廖曜生,法学博士,注水开发,Z.W, X.W, X.D.分析数据。y.s.、j.w.、c.l.、s.c.、j.z.和S.L.为手稿做准备。作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

给李章、华白或王杰的信件。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

本研究获得所有参与中心伦理委员会批准(NCC2016JZ-03, NCC2018-092),所有患者均提供书面知情同意书。获得每位受试者或每位受试者监护人的知情书面同意。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

Chengcheng Li和Shangli Cai是Burning Rock Biotech, Inc.的员工。其他作者宣称没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意事项gydF4y2Ba

万博平台登陆网址施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

补充信息gydF4y2Ba

附加文件1:表S1。gydF4y2Ba

NCC队列中的患者特征。gydF4y2Ba表S2。gydF4y2Ba本研究分析了8个非小细胞肺癌队列的详细资料。gydF4y2Ba表S3。gydF4y2Ba基于PROVEAN的每个PTPRD突变预测。gydF4y2Ba表S4。gydF4y2BaTCGA-LUSC队列的GSEA。gydF4y2Ba

附加文件2:图S1。gydF4y2Ba

PTPRD突变不是鳞状肺癌ICIs的预后生物标志物。a-c验证队列-1 (a)、验证队列-2 (b)、MSKCC-240队列(c) PTPRD突变/WT组鳞肺癌的PFS。d MSKCC-350队列中PTPRD突变/WT组鳞肺癌的OS。e-g验证队列-3 (e)、OAK (f)和POPLAR (g)队列中PTPRD突变/WT组鳞肺癌的PFS。在验证队列-3 (h)、OAK (i)和POPLAR (j)队列中,PTPRD突变/WT组鳞状肺癌的h-j OS。gydF4y2Ba图S2。gydF4y2Ba预测PTPRD突变的PFS效率在4个组织群组。PTPRD突变/ WT组NSCLC中的A-B PFS(a)或NS-NSCLC(b)以苗&N.Rizvi队列。PTPRD突变的c d PFS / WT组NSCLC(c)或NS-NSCLC(d)中的Hellmann队列。E-F PTPRD突变/在MSKCC-240队列WT组NSCC(e)或NS-NSCLC(F)的的PFS。gydF4y2Ba图S3。gydF4y2Ba预测两组组织队列中PTPRD突变的OS效率。a-b MSKCC-350中PTPRD突变/WT组NSCLC (a)或ns-NSCLC (b)的总生存率。c-d苗族人群中PTPRD突变/WT组NSCLC (c)或ns-NSCLC (d)的总生存率。gydF4y2Ba图S4。gydF4y2Ba在OAK/POPLAR队列中预测ctDNA PTPRD突变的预后效率。OAK (a)或POPLAR (b)队列中PTPRD突变/WT组NSCLC患者的a-b PFS。OAK (c)或POPLAR (d)队列中PTPRD突变/WT组ns-NSCLC的c-d PFS。OAK (e)或POPLAR (f)队列中PTPRD突变/WT组NSCLC的e-f OS。在OAK (g)或POPLAR (h)队列中,ns-NSCLC PTPRD突变/WT组的g-h OS。gydF4y2Ba图S5。gydF4y2Ba预测PTPRD其他基因突变的预后效率。在发现队列中,磷酸酶mut (a)或WT (b)与其他mut的PFS。nsclc验证队列-1中磷酸酶-mut (c)或WT (d)与其他mut的c-d PFS。验证队列-2中,nsclc中磷酸酶-mut (e)或WT (f)与其他-mut的OS。g-h验证队列-3合并队列中,nsclc中磷酸酶-mut (g)或WT (h)与其他mut的PFS。验证队列-3中,nsclc中磷酸酶-mut (i)或WT (j)与其他-mut的i-j OS。gydF4y2Ba图S6。gydF4y2Ba组织队列中PTPRD不同突变类型的预后预测效率。在MSKCC-240队列中,nsclc中WT vs磷酸酶-mut (a)、other-mut vs WT (b)、phosphatase-mut vs other-mut (c)的PFS。在Hellmann队列中,nsclc中WT vs磷酸酶-mut (d)、other-mut vs WT (e)、phosphatase-mut vs other-mut (f)的PFS。在Miao & N.Rizvi队列研究中,nsclc中WT vs . phosphatase-mut (g)、other-mut vs . WT (h)、phosphatase-mut vs . other-mut (i)的PFS。在MSKCC-350队列中,nsclc中WT vs磷酸酶-mut (j)、other-mut vs WT (k)、phosphatase-mut vs other-mut (l)的j-l OS。在Miao队列中,nsclc中WT vs磷酸酶-mut (m)、other-mut vs WT (n)、phosphatase-mut vs other-mut (o)的m-o OS。gydF4y2Ba图S7。gydF4y2Ba预测ctDNA队列中不同PTPRD突变类型的预后效率。一个-c PFS of WT vs phosphatase-mut (a), other-mut vs WT (b) and phosphatase-mut vs other-mut (c) in ns-NSCLC in the OAK cohort. d-f PFS of WT vs phosphatase-mut (d), other-mut vs WT (e) and phosphatase-mut vs other-mut (f) in ns-NSCLC in the POPLAR cohort. g-i OS of WT vs phosphatase-mut (g), other-mut vs WT (h) and phosphatase-mut vs other-mut (i) in ns-NSCLC in the OAK cohort. j-l OS of WT vs phosphatase-mut (j), other-mut vs WT (k) and phosphatase-mut vs other-mut (l) in ns-NSCLC in the POPLAR cohort.图S8。gydF4y2BaPTPRD磷酸酶突变预测预后的效率与TP53/EGFR/KRAS突变无关。a-d WES队列(a)、MSKCC-240和MSKCC-350队列(b)、OAK/POPLAR队列(c)和TCGA-LUAD队列(d)中PTPRD与TP53、EGFR、KRAS、STK11、KEAP1相互作用图。e-i发现队列(e)、验证队列-1(f)、验证队列-2(g)和验证队列-3 (h-i)中TP53/EGFR/KRAS的HR森林图。gydF4y2Ba图S9。gydF4y2BaPTPRD不是肺腺癌手术和辅助化疗预后的生物标志物。在TCGA-LUAD队列中,WT vs突变(a)或磷酸酶突变(b)的a-b PFS。c TCGA-LUAD中PTPRD表达的PFS值高vs低。在TCGA-LUAD队列中,WT vs突变(d)或磷酸酶mut (e)的d-e OS。在TCGA-LUAD中,PTPRD的表达量高vs低。gydF4y2Ba图S10。gydF4y2BaPTPRD突变预测其他癌症类型的预后效率。一个-f PTPRD mutations predicting OS efficiency in melanoma (a), bladder cancer (b), esophagastric cancer (c), head and neck cancer (d), colorectal cancer (e) and cancer of unknown primary (f) of NG1661 cohort.

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孙勇,段建军,方伟。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba组织或ctDNA PTPRD磷酸酶结构域有害突变作为非鳞NSCLC免疫检查点抑制剂的预后和预测生物标志物的鉴定和验证gydF4y2BaBMC医学gydF4y2Ba19,gydF4y2Ba239(2021)。https://doi.org/10.1186/s12916-021-02075-5gydF4y2Ba

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