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miR-124和miR-137抑制胶质母细胞瘤多形性细胞增殖,诱导脑肿瘤干细胞分化

摘要

背景

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是一种致命的中枢神经系统肿瘤,尽管通过手术、放疗和化疗进行了治疗。需要进一步深入了解驱动GBM形成的分子和细胞机制,以改善患者的预后。microRNA正在成为细胞分化和增殖的重要调节因子,并且已被尽管在多种癌症的病因学中已被证实,但microRNA在GBM中的作用仍知之甚少。在本研究中,我们研究了microRNA在调节神经干细胞和多形性胶质母细胞瘤肿瘤细胞的分化和增殖中的作用。

方法

我们使用定量RT-PCR来评估高级别星形细胞瘤和成年小鼠神经干细胞中的microRNA表达。为了评估候选microrna在高级别星形细胞瘤中的功能,我们将miR模拟物转染到培养的小鼠神经干细胞、小鼠少突胶质细胞瘤来源的干细胞、人胶质母细胞瘤多形性来源的干细胞和胶质母细胞瘤多形性细胞系。用免疫染色法检测细胞分化,用荧光活化细胞分选法检测细胞增殖。

结果

我们的研究显示,与非肿瘤性脑组织相比,间变性星形细胞瘤(世界卫生组织III级)和多形性胶质母细胞瘤(世界卫生组织IV级)中microRNA-124和microRNA-137的表达水平显著降低(P < 0.01)。生长因子去除后,培养的小鼠神经干细胞在分化过程中增加了8- 20倍。5-aza-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)抑制DNA甲基化后,多形胶质母细胞瘤U87和U251细胞中microRNA-137的表达增加了3至12倍。转染microRNA-124或microRNA-137可诱导小鼠神经干细胞、小鼠少突胶质细胞瘤来源的S100β-v-干细胞的形态学改变和与神经元分化一致的标记物表达erbB133+人胶质母细胞瘤多形性干细胞(SF6969)。转染microRNA-124或microRNA-137也可诱导U251和SF6969多形性胶质母细胞瘤细胞G1周期阻滞,这与细胞周期蛋白依赖性激酶6和磷酸化视网膜母细胞瘤(pSer 807/811)蛋白表达降低有关。

结论

microRNA-124和microRNA-137诱导成年小鼠神经干细胞、小鼠少突胶质瘤源性干细胞和人多形性胶质母细胞瘤源性干细胞分化,并诱导多形性胶质母细胞瘤细胞周期阻滞。这些结果表明,靶向性地将microRNA-124和/或microRNA-137输送到多形性胶质母细胞瘤肿瘤中r细胞对这种疾病的治疗可能是有效的。

同行评审报告

背景

microrna (mirna)是一类小型非编码RNA,通过基于RNA干扰的机制调控多种细胞过程。mirna被转录为初级RNA转录本(pri- mirna),在细胞核中加工成较小的发夹前体结构(pre- mirna),然后输出到细胞质中,在那里它们进一步被Dicer核酸酶加工成成熟的、有功能的mirna,长度约为21个核苷酸。成熟mirna,内源性的等效短干扰rna (sirna),然后被纳入rna诱导的沉默复合物中,通过翻译抑制或信息切割促进它们与靶信使rna (mrna)的相互作用和抑制(参见[1.])。

自从最初发现mirna作为发育突变体在秀丽隐杆线虫,它们作为干细胞分裂和发育的重要调节因子在进化分化的生物体中的作用越来越明显。例如,RNaseIII酶Dicer的功能性消融,导致miRNA生物发生的消融,扰乱了昆虫生殖系干细胞的分裂[2.和小鼠胚胎干细胞[3.],并损害斑马鱼的早期胚胎发育[4.]还有老鼠[5.].越来越明显的是,mirna在癌症病因学中发挥着重要作用。例如,mir-17-92 miRNA簇的表达增强了肿瘤血管生成[6.加速c- myc诱导的小鼠b细胞淋巴瘤的发生[7.,而let-7 miRNA则转录调控ras致癌基因(8.]及抑制肺腺癌细胞的生长[9]此外,miRNA加工的损伤增强了细胞转化和肿瘤发生[10],这与观察结果一致,即与正常组织相比,多种肿瘤类型中mirna的整体下调发生在多个肿瘤类型中[11].

最近,特异性的mirna被发现与小鼠胚胎干细胞(ES)和小鼠肿瘤培养的分化有关。例如,在小鼠ES细胞来源的神经祖细胞分化过程中,miR-124和miR-9的表达增加,而对miR-124和miR-9表达的实验操作影响ES细胞来源的培养中神经谱系的分化[12].miR-124的上调也可诱导小鼠神经母细胞瘤细胞株CAD、Neuro2a和小鼠胚胎瘤细胞株P19的神经分化[13].这些结果表明,如果mirna同样促进人肿瘤细胞和肿瘤干细胞(TSCs)的分化,它们可能是有价值的治疗药物。

发现一种罕见的、高度致瘤性的、自我更新的多形性胶质母细胞瘤细胞亚群,表达细胞表面标记分化簇(CD) 133(见[14,15),即所谓的GBM干细胞群,表明有效抑制或杀死CD133+ GBM干细胞的治疗方法可能导致患者预后的显著改善。为此,最近有研究证明骨形态发生蛋白4诱导CD133+ GBM细胞分化能有效抑制小鼠脑内GBM肿瘤的生长[16].鉴于越来越多的证据支持miRNA在促进干细胞分化中的作用,我们研究了miRNA在人类GBM干细胞、小鼠少突胶质瘤干细胞(mOSCs)和正常成年小鼠神经干细胞(mNSCs)的分化和增殖中的作用,这些细胞被认为是成年胶质瘤的祖细胞[17].我们的研究结果表明,miR-124和miR-137可以诱导OSCs和GBM干细胞的神经元分化,抑制GBM细胞株的增殖。这些结果表明,miR-124和miR-137可能是治疗gbm的有用药物。

方法

主要的人体组织

根据人类研究委员会批准的程序,新鲜冷冻的初级人体组织从加州大学旧金山分校(UCSF)脑肿瘤研究中心组织核心获得。神经病理学家(S Vandenberg)对所有样本进行了彻底的检查,间变性星形细胞瘤(AAs)和GBM肿瘤被证实含有至少90%的肿瘤。非肿瘤性脑组织来源于癫痫患者手术后的颞叶,主要由皮质和轻度到中度反应性星形细胞和神经元组成。有关示例的详细信息,请参阅附加文件1.

定量逆转录聚合酶链反应

使用miR-Vana RNA分离系统(Ambion, Austin TX)提取总RNA。使用TaqMan定量检测192个人mirna在人组织中的表达®miRNA检测human panel-early access kit (Applied Biosystems, Foster City CA)。在NSC分化过程中,6个高级别星形细胞瘤(HGA)-miRNAs的表达被单个TaqMan定量®MicroRNA化验。比较Ct (ΔΔCt)法检测表达倍数变化。

统计分析

使用免费提供的R语言对原发性组织中的miRNA表达进行统计分析,分析log2转化的折叠变化数据。使用Bioconductor中的limma软件包比较三种原发性组织(胶质细胞、AAs和GBMs)t-统计数字如其他资料所述[18通过控制错误发现率,对p值进行多次比较调整。如果错误发现率小于0.05,则认为改变是显著的。

去甲基化和去乙酰化实验

U87和U251胶质瘤细胞株按1 × 10播种5.在Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)高葡萄糖10%血清中孵育24小时,然后加入含有5-aza- dc(1或5 μM;trichostatin A (TSA) (100ng /ml;(Sigma-Aldrich) 12小时。在组合试验中,1或5 μM 5-aza- dc存在72小时,TSA持续12小时。含药物的培养基每24小时更换一次。

miRNA寡核苷酸

miRNA模拟阴性对照(cell - mir -67)和miRNA模拟(mumu - mir -124, mumu - mir -137)购自Dharmacon (Lafayette, CO),并使用pMIR-REPORT miRNA表达报告载体系统(Ambion, Austin, TX)进行验证。有关结果,请参阅附加文件2.

CDK6-3'UTR miR-137报告基因检测

在U251细胞中进行周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6)-3'UTR报告基因检测。含有野生型(WT) miR-137结合位点或突变型(MUT) miR-137结合位点的CDK6-3'UTR序列的pmir报告载体通过克隆以下寡核苷酸生成HindIII斯佩pMIR报告的限制性位点:CDK6-UTR-WT fw 5'-AGCTTGATCAGAAATATGATGCTGATATATATATTAAAACTA CDK6-UTR-WT rv 5'-CTAGTTAGTTATTATGATCAATATATAGCTAGATCAGTAGATCAGCATATTTCTGTAGATCA CDK6-UTR-MUT fw 5'-AGCTTGATCACACAGAAATCAGAGAGATATCAATATTATTCAATTCATATATTATTCAATTATCA CDK6-CTAGATGCATTATGATTATTCAATTATGATTATCA细胞为ATTCTR细胞受(1)miR-137或cel-miR-67-阴性对照模拟物(50nM),(2)含有WT或MUT miR-137结合位点(400ng)和(3)表达pRL-SV40(Promega)的pMIR报告载体影响Renilla荧光素酶(400 ng)用于正常化。细胞在添加10%胎牛血清的高糖DMEM中生长,并在转染后48小时使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)进行荧光素酶测量。

小鼠脑室下区nscs的建立和转染

成年小鼠脑室下区(SVZ)-NSC培养物如前所述衍生和生长[19]经过一些修改。2个月大的CD-1小鼠(Charles River实验室)的SVZ显微解剖分离成含有0.25%胰蛋白酶、0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)和温和研磨的单细胞悬浮液。细胞在22%Percoll(Sigma)阶跃梯度(2)上清除,并在增殖培养基中生长(DMEM/F12/N2)、5%胎牛血清(FCS)、20 ng/ml表皮生长因子(EGF)、20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和35μg/ml牛垂体提取物(所有培养基和补充剂均来自Invitrogen,Inc.)。1天后收集未附着的细胞,并重新植入35 mm组织培养皿(康宁).7至10天后,培养板与SVZ NSCs高度融合,常规用0.25%胰蛋白酶和0.5 mM EDTA以1:2传代。细胞在用于实验前至少传代6次。培养基每2天更换一半,每4天更换一次。SVZ NSCs在miRNA表达时间过程中的分化为通过从培养基中去除EGF、FGF和FCS而产生[19].

为了将miR-124/137转染到SVZ NSCs中,在转染前24小时,将50000个细胞接种到8个经0.1 mg/ml聚D-赖氨酸(Sigma)和10μg/ml层粘连蛋白(Invitrogen)预处理的孔培养玻片(BD Falcon Biosciences)中。总共100 nM miRIDIAN miRNA模拟物(miR-124和miR-137共转染各50 nM)与LipofectAMINE 2000(Invitrogen)复合并直接添加到增殖培养基中生长的细胞中。转染后12至24小时去除转染和增殖培养基,并如上所述诱导细胞分化。

S100βv-的生长和转染erbB小鼠肿瘤干细胞

成年肿瘤干细胞来源于120日龄FVB/N转基因小鼠的低级别少突胶质细胞瘤,表达v-erbBS100β启动子控制下的转基因[20.].从周围的正常脑组织中显微解剖肿瘤组织,用木瓜蛋白酶分离成单细胞悬液,轻轻研磨并通过40 μ m筛网(Falcon)过滤。在低贴壁的组织培养皿(康宁)中,在含有20 ng/ml EGF (Sigma)、20 ng/ml bFGF (Peprotech)和B27 (Invitrogen)的神经基底培养基(Invitrogen)中培养单个细胞形成神经球。四次传代后,神经球分离并复制到10厘米的培养皿中(康宁)增殖培养基中(见上文)。这些TSCs具有自我更新和多能性,并在分化条件下表达星形胶质细胞(胶质纤维酸性蛋白,GFAP)、神经元祖细胞(Tuj1)和少突胶质细胞祖细胞(NG2)的标记物。

对于miRNA转染,在转染前24小时,25,000个细胞被放置到8孔预包被培养皿(Nunc)中。按照SVZ-NSC培养的方法进行转染和分化。

早期传代人GBM细胞(SF6969)的生长、CD133筛选及转染

在加州大学旧金山分校知情同意后,通过手术摘除人体GBM组织,并使用Hank的无镁和钙缓冲盐水溶液清洗。然后用木瓜蛋白酶(Worthington)在37°C下酶解肿瘤30分钟。离心后,用pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水冲洗1次,将细胞转移到NBE培养基中,NBE培养基由不添加维甲酸(Invitrogen)的神经基底培养基、N2和B27(各0.5×;Invitrogen)、20 ng/ml人重组bFGF (Peprotech)和20 ng/ml人重组EGF (Sigma-Aldrich)。细胞被镀在极低粘附板(康宁)。培养基每3 - 5天更换一次。

用accutase(创新细胞技术)在37°C下分离悬浮培养的细胞30分钟。在RinseMACS缓冲液(Miltenyi Biotech)中洗涤一次后,用偶联CD133/1抗原表位抗体的磁珠孵育细胞。细胞与珠在4℃下孵育30分钟。之后,用20× RinseMACS缓冲液清洗细胞,离心并添加到连接到预分离过滤器的大细胞柱上。荧光激活细胞分选分析证实了纯CD133-部分和高富集CD133+部分。

对于转染,将CD133+和CD133-细胞(每孔20000个细胞)被镀在24孔板上,涂层有聚约氨酸和层粘连蛋白。用lipofectamine转染miR-124和/或miR-137 (100 nM)或阴性对照寡核苷酸4小时。然后将细胞洗涤,在不含生长因子的NBE培养基中培养10天。

免疫细胞化学

干细胞培养物在一抗孵育前进行固定、清洗和预阻断(Tuj1, 1:500, Covance Inc;GFAP,兔多克隆,1:50 00,Dako公司;微管相关蛋白2 (MAP2) ab, 1:500, Sigma)。然后用Alexa488-或alexa594标记的二抗对细胞进行染色,细胞核用Hoechst 33258 (Molecular Probes)或DAPI (Sigma)进行反染色。

细胞周期分析

按照制造商的建议(BD Pharmingen,加利福尼亚州圣地亚哥),使用异硫氰酸荧光素BrdU流动试剂盒进行细胞周期分析。

免疫印迹

采用标准的CDK6抗体(1:1000;Cell Signaling, Temecula, CA), Phospho-Rb (1:1000;Cell Signaling Technology, Temecula, CA)和β-actin (1:50 000;Sigma, St Louis, MO)。

有关实验方法的更多详细信息,请参阅附加文件3.

结果

miR-124和miR-137在高级别胶质瘤中下调,在成人NSC分化中上调

识别以前未涉及GBM细胞的未调控mirna [21,22],采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR;Taqman)来衡量192年成熟的microrna的表达序列在人类non-neoplastic脑组织(glioses)、原子吸收光谱法(世界卫生组织(世卫组织)三级)和本研究(四年级)。比较Ct(ΔΔCt)方法用于确定每个microrna的表达褶皱变化肿瘤样本相对于glioses(见附加文件4.).简单地说,每个miRNA的ΔCt是相对于let-7a和miR-16确定的,这是内源性的控制miRNA,在所有的样本中都稳定地表达(见附加文件)5.),四种胶质细胞的平均ΔCt作为肿瘤样本的校正器。与之前在GBMs中的观察结果一致,我们观察到miR-10b的反复上调[22]和miR-21[21]在我们的样本集中;在四分之二的AA和四分之二的GBM肿瘤中,miR-10b上调超过100倍;在四分之二的AA和四种GBM肿瘤中,miR-21上调5- 30倍。也与先前对其他肿瘤类型的研究一致[11,我们观察到AA和GBM肿瘤相对于非肿瘤性脑组织的表达整体下降。

接下来,我们对我们的miRNA表达数据进行了统计分析,以识别HGAs中感兴趣的新miRNA (GBM和AA)。有关这些分析的摘要,请参阅附加文件6..如表所示1.,我们发现有35个mirna在AA或GBM肿瘤中明显失调(P < 0.05)。13个(37%)的mirna在两种肿瘤中相对于胶质细胞有差异表达,16个(45%)仅在GBM肿瘤中有差异表达,6个(17%)仅在AA肿瘤中有差异表达。我们鉴定了6种特别感兴趣的mirna, miR-7, miR-124, miR-129, miR-137, miR-139和miR-218,它们在AAs和GBMs中均下调(图)1额外的文件8.和表1.的显著性(P≤0.01)。下面我们将这六种miRNAs称为HGA-miRNAs。

表1间变星形细胞瘤和/或胶质母细胞瘤多形性肿瘤中相对于非肿瘤性脑组织的差异表达microrna
图1
图1

在DNA去甲基化剂处理后,miR-124和miR-137在间变星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中下调,在多形性胶质母细胞瘤细胞系中上调.(A)相对于let-7a(黑点)和miR-16(白点),在单个肿瘤样本中测量高级别星形细胞瘤- microrna的表达。样本类型为胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。(B) 5-aza- dc单独以1 μM (Aza.1)或5 μM (Aza.5)处理多形性胶质母细胞瘤细胞系(U87和U251), trichostatin A单独(100 ng/ml)或两者联合处理。相对于let-7a测量MicroRNA的表达,并归一化到载体对照(二甲基亚砜)。误差棒表示三次重复聚合酶链反应与单一实验集的标准偏差。在独立实验中也得到了类似的结果(见附加文件)8.).

我们观察到,大多数HGA miRNA在光感受器分化过程中表现出表达变化,或与多种细胞系的分化有关:miR-7在光感受器分化过程中[23];红细胞生成过程中的miR-124和miR-137 [24];miR-124和miR-218在胚胎癌细胞分化中的神经分化[25]在ES细胞的神经元分化过程中miR-124[12].为了检测hga - mirna的表达是否在成年NSCs分化过程中改变,推测为高级别胶质瘤的前体细胞[17]如前所述,我们建立了SVZ-NCS的早期传代(第6代)培养[19].这是一种单层NSC培养系统,生长因子迅速撤离(2 - 4天内)诱导出大量神经母细胞,在3 - 4天分化后约占总细胞的50%。与先前的研究一致[19,我们观察到Tuj1+神经母细胞的数量在5天的分化过程中稳步增加(图2).在平行培养中,我们每24小时测量一次miRNA表达,连续5天(图)2 b).miR-124和miR-137的表达分别增加到8倍和24倍,miR-129和miR-139的表达分别减少到2倍和4倍,miR-7和miR-218的表达没有明显变化。

图2
figure2

脑室下区-神经干细胞分化过程中MiRNA的表达.(A)成年神经干细胞神经发生过程中的标记物表达。显微照片显示在增殖(A)-(D)条件下增殖的脑室下区-神经干细胞培养,以及随后1天(E)-(H), 2天(I)-(L), 3天(M)-(P)和4天(Q)-(T)的丝裂原剥夺条件下。相图(A), (E), (I), (M), (Q)与相应的荧光图像显示4'-6-二胺基-2-苯基林多核染色(B), (F), (J), (N), (R)和Tuj1表达(C), (G), (K), (O), (S)。平行培养中显示胶质纤维酸性蛋白表达(D), (H), (L), (P), (T)。(B)脑室下区-神经干细胞5天分化过程中高级别星形细胞- microrna的表达分析。

我们在mNSCs中的分化研究表明,生长因子信号在HGAs中反复激活,抑制了miR-124和miR-137的表达。也有研究表明,miR-124的表达在包括结肠直肠癌和乳腺癌在内的许多肿瘤类型中受到表观遗传抑制[26].此外,miR-137与一个巨大的CpG岛密切相关[27,这表明它在肿瘤中也可能是表观遗传沉默的。因此,我们检测了在DNA甲基化抑制剂5-aza-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,miR-124和miR-137的表达是否能被激活。5-aza- dc (5 μM)和TSA联合处理后,在U251和U87细胞中MiRNA-124的表达增加了约2倍1 b和额外的文件8.).MiRNA-137在5-aza-dC处理的GBM细胞中表达增加了8倍,在5-aza-dC和TSA处理的细胞中表达增加了12倍(图)1 b和额外的文件8.).两种miRNA的表达在单独使用TSA处理的细胞中保持相对不变(图1 b和额外的文件8.).这些数据表明,CpG岛调控序列的表观遗传修饰可能有助于gbm中miR-124和miR-137的沉默。

miR-124和miR-137促进成年NSCs的神经元分化

为了检测miR-124和miR-137的上调是否会促进成年mNSCs的分化,我们将增殖的mNSCs转染与每个miRNA成熟序列相对应的双链RNA寡核苷酸。在每个实验中,至少达到80%到90%的转染效率。NSCs在转染过程中维持在增殖培养基中,细胞一般呈梭形非神经元形态,高表达干细胞和星形细胞标记物GFAP,但低表达神经元标记物Tuj1(图)2)。转染后12至24小时,提取生长因子,并允许细胞分化72小时。转染miR-124或miR-137导致神经元标记物Tuj1染色的细胞数量比对照组增加5倍(图3 a, B3 c).每个miRNA也有明显的形态学变化;miR-124诱导细胞的神经炎分支,而miR-137诱导圆形或梯形细胞外观,无神经炎生长(图33 b).与miR-124或miR-137单独转染相比,miR-124和miR-137联合转染导致Tuj1+细胞增加近2倍,但不促进神经元形态学特征(图3 c).最后,转染miR-124,而不是miR-137,导致gfap阳性细胞数量减少2倍(图)33 c).因此,过表达miR-124和miR-137可以增强成年NSCs的神经元样分化在体外

图3
图3

miR-124和miR-137促进脑室下带-神经干细胞的神经元分化.(A)转染miR-124、miR-137和对照寡核苷酸72小时后心室下区-神经干细胞的表观荧光图像。细胞用Tuj1和胶质纤维酸性蛋白抗体免疫染色,细胞核用4'-6-二氨基-2-苯基吲哚-反染色,图像合并。比例尺为10 μm。(B) miR124和miR137转染48小时后心室下区-神经干细胞的相位对比图像,同样的培养物转染72小时后的Tuj1免疫染色。(C)转染miR-124、miR-137、miR-124和miR-137、对照寡核苷酸或转染试剂72小时后,定量Tuj1+细胞、具有神经元形态的Tuj1+细胞和胶质纤维酸性蛋白+细胞的百分比。

miR-124和miR-137促进脑TSCs的神经元分化

由于我们观察到miR-124和miR-137在HGAs中的表达降低,miR-124和miR-137促进非肿瘤性成年mNSCs的分化,我们接下来测试miR-124和miR-137的上调是否可以促进脑肿瘤来源的干细胞的分化。我们首先评估了由S100β-v-衍生的mOSCs的分化erbB转基因小鼠少突胶质细胞瘤[20.].MiRNA-124在人类少突胶质细胞瘤中下调[28而在S100β-v-中miR-124和miR-137均下调10倍以上erbB相对于mNSCs的肿瘤干细胞(附加文件7.).与我们在mNSCs中的观察结果一致,我们观察到,在转染miR-124、miR-137或两者的组合后,表达神经元标记物Tuj1的细胞数量显著增加(图)4).用miR-124或miR-137转染可导致Tuj1阳性细胞的圆形或梯形细胞形态,减少神经炎的生长。我们还观察到,转染miR-124和miR-137可减少GFAP阳性MOSC的数量(图4).

图4
装具

miR-124和miR-137诱导肿瘤源性神经干细胞向神经元分化.(A)单独转染miR-124、miR-137、对照寡核苷酸和lipofectamine试剂72小时后肿瘤来源的神经干细胞的表观荧光图像。细胞用Tuj1和胶质纤维酸性蛋白抗体进行免疫染色,用Hoechst 33258试剂进行DNA染色。转染和染色后,量化每个样本中Tuj1-和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的百分比,并与计数的细胞总数(n= 450)。(C)转染miR-124、miR-137或对照寡核苷酸10天后,原代多形性胶质母细胞瘤中Tuj1+和胶质纤维酸性蛋白+细胞的定量分析。插图显示了miR-124和/或miR-137共转染的具有神经元形态的Tuj1+细胞。(D)在多形性胶质母细胞瘤细胞系中转染miR-137或阴性对照mir后10天,使用神经标记物Tuj1和微管相关蛋白2进行免疫染色,维持神经球状态。

接下来,我们测试了miR-124和miR-137是否能促进人类GBM干细胞的分化。GBM细胞从原发性肿瘤(SF6969)中分离出来,并在非粘附板中扩增为肿瘤球。使用与CD133抗体结合的磁珠对细胞进行分类,CD133是GBM干细胞的一种假定标记物[14,15].用miR-124和/或miR-137转染CD133+和CD133-细胞,然后在不含生长因子的NBE培养基中培养10天。转染miR-124和/或miR-137显著增加了tuj1阳性细胞的百分比,降低了gfap阳性细胞的百分比以及CD133+和CD133- GBM细胞的百分比(图)4 b).Tuj1在神经元形态的细胞中表达,也在圆形细胞和有丝分裂的细胞中表达。gfap阳性细胞的表达局限于I型和II型星形胶质细胞的典型形态。

为了进一步研究miR-137在GBM细胞神经元分化中的作用,我们评估了在过表达miR-137后另一种神经元标志物MAP2的表达。将未分选的SF6969 GBM细胞转染miR-137,在不含生长因子的NBE培养基中培养10天。除了Tuj-1阳性细胞在10天后预期的增加外,我们还观察到转染miR-137后map2阳性细胞的明显增加(图)4摄氏度).同样,在mNSCs和少突胶质细胞瘤球体中,miR-137诱导的圆形形态几乎没有神经炎生长的证据(图)4摄氏度).总的来说,我们的结果表明,在缺乏生长因子信号的情况下,miR-124和miR-137可以增强少突胶质细胞和GBM细胞TSCs的神经元样分化。

miR-124和miR-137抑制GBM细胞株的增殖

由于诱导分化需要细胞周期的退出,我们测试了miR-124和miR-137是否抑制GBM细胞的增殖。相对于对照寡核苷酸,转染miR-124或miR-137导致U251 GBM细胞中处于细胞周期s期的细胞数量显著减少,G0/G1期的细胞数量显著增加(图)5)和来自新诊断的人类GBM的早期传代GBM细胞(图5 b).在细胞周期的G2/M细胞中,或在任何细胞系中进行凋亡(G1)的细胞中,均未观察到可重复的差异(数据未显示)。我们的数据表明,miR-124和miR-137在GBM细胞中诱导G0/G1细胞周期阻滞。

图5
figure5

miR-124和miR-137抑制胶质母细胞瘤多形性干细胞增殖,诱导细胞G0/G1周期阻滞.在转染100 nM(最终总microRNA浓度)miR-124、miR-137、miR-124和miR-137或阴性对照寡核苷酸(neg#1, neg#2)到U251 (A)和SF6969 (B)多形性胶质母细胞瘤细胞后48小时,通过荧光激活的细胞分选仪进行细胞周期分析。细胞经溴脱氧尿苷处理30分钟,固定,异硫氰酸荧光素标记的抗溴脱氧尿苷抗体处理,7-氨基放线菌素D DNA染色,流式细胞术检测。值为重复实验的平均值±标准差;* P < 0.05。

miR-124和miR-137抑制GBM细胞中CDK6的表达和磷酸化的视网膜母细胞瘤水平

为了确定miR-124和miR-137诱导GBM细胞G0/G1细胞周期阻滞的分子机制,我们评估了细胞周期和分化调节因子CDK6的表达(综述见[29),然后将这些mirna转染到U251细胞。CDK6是HCT-116结肠癌细胞中miR-124的一个确定靶点[26]是miR-137的预测靶点(TargetScan和PicTar),在功能上与多种恶性肿瘤的发生有关。在独立实验中,我们观察到CDK6转录本显著减少(图6)和CDK6蛋白(图6 b)对miR-124和miR-137转染的响应。磷酸化视网膜母细胞瘤(RB) (pSer 807/811)的水平,一个已知的CDK6靶点[30.],对miR-124和miR-137转染也降低(图6 b).

图6
figure6

在胶质母细胞瘤多形性细胞中,miR-124和miR-137抑制CDK6的表达.(A)与转染100nm对照寡核苷酸的细胞相比,转染100nm miR-124或miR-137在48小时内降低U251细胞周期素依赖性激酶6 mRNA转录水平50%。相对于对照基因,周期蛋白依赖性激酶6的表达由TaqMan测定格斯(黑条),GAPDH(灰条)18岁(白色条)。数值代表独立实验的平均+/-标准偏差。(B)通过转染miR-124或miR-137后的western blotting测定,细胞周期蛋白依赖性激酶6蛋白表达显著降低。磷酸化RB水平(pSer 807/811)miR-137序列与含有预测的细胞周期蛋白依赖激酶6 miR-137结合位点(野生型)的pMIR报告载体有关。突变碱基(下划线)也被引入到细胞周期蛋白依赖激酶6-3'UTR的miR-137种子区(框中)(突变)。垂直线表示Watson-Crick碱基配对。(D)转染miR-137或阴性对照microRNA后,U251细胞与野生型或突变的细胞周期蛋白依赖激酶6报告构建物结合后的相对发光。*P<0.0001。

为了验证CDK6的3' UTR是miR-137的直接靶点,我们使用了一个荧光素酶报告系统,在该系统中,预测的CDK6的miR-137结合位点被克隆到荧光素酶下游。我们还开发了一个对照报告载体,其中miR-137结合位点的种子区发生了突变(图)6摄氏度).将WT CDK6-3'UTR (CDK6-WT)报告细胞和miR-137 mimic共转染U251细胞后,相对于CDK6-WT和阴性对照miRNA mimic共转染的细胞,发光率显著降低(P < 0.0001)(图)6 d).CDK6 miR-137种子区突变使报告细胞对miR-137的抑制不敏感(图)6 d).因此,除了miR-124之外,miR-137也是CDK6的直接抑制剂。

讨论

高级别胶质瘤中mirna的鉴定

为了识别在高级别胶质瘤中反复出现的miRNAs,我们使用定量RT-PCR分析192个miRNAs在人类非肿瘤性脑组织、AAs和GBMs中的表达。从我们的分析中,我们发现了一些以前在GBM肿瘤中描述过的mirna,如miR-10b(见[22])以及凋亡调节因子miR-21(参见[21,22,31])。我们还鉴定了一些mirna,包括miR-124和miR-137,这些在以前的GBM分析研究中没有被描述。目前尚不清楚为什么mir - 124和mir - 137没有发现以前在GBM肿瘤,特别是根据我们的研究结果表明戏剧性的表达减少mir - 124和mir - 137本(AAs)相对于non-neoplastic脑组织,和结果显示明显的下调mir - 124表达在人类间胶质瘤(28,人类星形细胞瘤[32和GBM细胞系[32,33].

另一个显著的差异是miR-221的表达,在我们的研究中测试的任何肿瘤中miR-221都没有过表达,但Ciafre等人研究的9种gbm中有5种显示过表达[22],并已被证明可抑制GBM细胞中细胞周期抑制剂p27(Kip1)的表达[34]我们的研究与以前的GBM分析研究之间最明显的区别是:(1)对照组织,癫痫手术中的成年胶质,GBM分子分析研究中常用的对照组织,与正常人胎儿大脑和肿瘤周围的宏观特征手术标本相比[21,22];(2)分析技术,TaqMan与微阵列[21,22].未来对大量患者样本的分析研究将有助于解决这些明显的差异。

我们的表达分析显示,共有35个mirna在高级别胶质瘤和非肿瘤性脑组织中有差异表达(P < 0.05,表)1.)。这些miRNA中的绝大多数下调(35个中的29个;83%),这与观察到的miRNA在多种肿瘤类型中的表达普遍下调一致[11].在这35个miRNAs中,我们鉴定了6个HGA-miRNAs,它们在AA和GBM肿瘤中均以更严格的显著程度下调(P < 0.01): miR-7、miR-124、miR-129、miR-137、miR-139和miR-218。由于miR-124和miR-137在成年NSC分化过程中的表达升高,我们将这6种mirna的进一步分析限制在miR-124和miR-137上(图)1 b),对其他HGA miRNA的评估可能会对高级胶质瘤的生物学产生新的见解。同样,对仅在AA肿瘤或仅在GBM肿瘤中差异表达的miRNA的评估(表1)1.)可能有助于阐明这些不同肿瘤分级背后的生物学差异。

值得注意的是,我们的miRNA表达谱研究是在组织水平进行的,而不是在细胞水平,这对解释我们的结果具有重要意义。特别是前期工作[28]的研究表明,miR-124仅在成年人脑神经元中表达,这表明我们在HGAs中观察到的miR-124表达下降可能是与非肿瘤性胶质细胞对照相比,肿瘤组织中神经元相对较少的结果。虽然这并不改变我们的结论,miR-124和miR-137可以诱导mNSC-, mOSC-和人gbm来源的干细胞(hGSC)分化,但它表明原位miRNAs在HGAs、非肿瘤性成人脑组织以及胎儿和出生后哺乳动物中枢神经系统发育过程中的表达分析,将是研究miRNAs在正常大脑发育和肿瘤发生过程中的功能的重要组成部分。

我们还注意到,在这项研究中,我们分析了目前在miRBase中描述的533个已知人类mirna中的192个(release 10.0)。35]),这反映了自我们的miRNA表达研究开始以来,miRNA发现的快速步伐。可能对脑肿瘤生物学具有潜在意义的miRNA尚未在此进行评估。这种miRNA的例子包括那些在脑组织中表现出丰富表达的miR-451和miR-488(参见[32])以及与其他肿瘤类型的病因有关的mirna,如滤泡性甲状腺癌中的miR-346 [36]因此,在与临床数据(如生存率和治疗反应)相关的大型HGA肿瘤组中,需要进行全面的miRNA表达研究,以便深入评估miRNA在脑癌病因和治疗中的作用。

miR-124和miR-137表达的调控

我们的结果揭示了miR-124和miR-137在干细胞和/或肿瘤细胞中可能受到抑制的两种潜在机制。第一种机制是生长因子信号传导:从培养基中去除EGF和FGF导致成年神经干细胞中miR-124和miR-137的表达显著增加[37], PDGF [38]及FGF [39miR-124和/或miR-137的表达和NSC/TSC的分化是生长因子信号促进脑肿瘤形成的一种机制。需要进一步的分析来确定EGF-、FGF-和pdgf诱导的信号通路对成年NSCs和GBM肿瘤干细胞中miR-124和miR-137转录抑制的相对贡献。

miR-124和miR-137在GBM干细胞中表达可能被抑制的第二个机制是通过其转录调控序列的表观遗传修饰。事实上,最近已经报道了其他肿瘤类型中特定mirna的表观遗传修饰。例如,与匹配的正常组织相比,miR-127在前列腺、结肠和膀胱肿瘤中下调,但在这些肿瘤类型的细胞系中,抑制DNA去甲基化和组蛋白去乙酰化酶后上调[40].我们的研究特别感兴趣的是,miR-124在超过三分之一的结肠癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤和白血病原发肿瘤中是高甲基化的,并且在乳腺癌(MCF-7)和结肠癌(HCT-116)癌细胞中在DNA去甲基化后上调[26]我们观察到,经DNA去甲基化剂5-aza-dC处理后,GBM细胞系U87和U251中的miR-137表达增加(图1 b).有趣的是,在5-aza-dC处理后,我们没有观察到miR-124的表达增加。进一步分析原发性肿瘤、TSCs和NSCs中miR-137和miR-124启动子序列甲基化,有助于确定表观遗传机制在HGAs中对这些mirna的抑制程度。

miR-124和miR-137对细胞分化和细胞周期的调控

既往研究表明,miR-124在啮齿动物神经系统发育过程中上调[41,42],以及小鼠ES细胞神经元分化过程[12],以及小鼠和人类胚胎癌细胞[25]此外,miR-124在小鼠ES细胞中异位过度表达后,神经元分化增强[12,小鼠神经母细胞瘤细胞[13和小鼠胚胎癌细胞[13]我们的结果表明,miR-124或miR-137的过度表达促进非肿瘤性成人(mNSCs)、MOSC和CD133+hGSCs的神经元样分化。因此,我们的研究首次将miR-124与出生后NCS和脑TSC的神经元分化联系起来。

miR-124诱导强大干细胞分化的能力似乎依赖于细胞类型、发育时机和其他尚未识别的因素。例如,在小鼠神经母细胞瘤细胞系CAD和Neuro2a,异位的老年病mir - 124单独是充分诱导neuron-like分化,而在老鼠胚胎细胞癌(P19), mir - 124增强神经元分化只在视黄酸的存在,一个确定的P19神经元分化的诱导物13].对miR-124在鸡胚脊髓发育过程中的表达和功能的研究已经确定,miR-124的原神经活性充其量是微妙的[43,44,这表明在这个发育阶段,健壮的神经发生需要额外的因素和/或信号。我们的研究表明,miR-124和miR-137在缺乏生长因子信号的情况下可增强mNSCs、mOSCs和hGSCs的神经发生。虽然我们还没有检测miR-124和miR-137单独是否能诱导本研究中所检测的各种干细胞的分化,但转染miR-124或miR-137单独足以诱导标准GBM细胞株的G1细胞周期阻滞(图)5).然而,在去除生长因子的miR-124和mir -137转染的GBM细胞(SF6969)中,细胞周期阻滞更为明显(图)5 b)总之,在缺乏生长因子的人类细胞中观察到miR-124和miR-137过度表达对细胞分化和增殖的最强烈影响(图4 b5 b)总之,我们的结果表明,尽管miR-124和miR-137有能力在人类GBM细胞和干细胞中单独诱导细胞周期阻滞和分化,但消除生长因子信号可增强其诱导分化的能力。需要更多的研究来解决这一假设,并纳入额外的GBM和干细胞少突胶质细胞瘤神经球细胞系将被要求解决我们的结果在这些疾病的生物学和治疗学方面的普遍适用性。

最近的研究开始揭示miR-124调控分化和增殖的分子机制。例如,miR-124直接靶向PTBP1 (PTB/hnRNP I) mRNA,这是非神经元细胞中替代前mRNA剪接的整体抑制因子,导致从非神经元到神经元特异性的替代剪接模式的转变[13]miR-124还直接靶向并抑制小C端结构域磷酸酶1(SCP1)的表达,SCP1是神经元基因表达的抑制剂[44]最后,miR-124在HCT-116结肠癌细胞中的过度表达抑制了CDK6的表达,CDK6是miR-124的既定靶点(参见[26])。我们的研究表明,miR-137和miR-124抑制了两种mirna的预测靶点CDK6的表达。此外,与miR-124a一样(见[26]),我们的结果表明miR-137是CDK6的直接抑制剂。miR-124或miR-137的过度表达也降低了磷酸化RB的表达(图6 b),是CDK6的下游靶点[30.].有趣的是,已知CDK6调节细胞周期进展和分化(在[29]),提示mir-124-和mir- 137介导的CDK6抑制可能是本研究中观察到的对GBM细胞增殖和分化的影响的部分原因。需要进一步的研究来确定在GBM干细胞中CDK6下调与细胞周期阻滞和/或分化之间的关系,并识别和表征额外的miR-124和miR-137靶基因。

miR-124和miR-137的治疗潜力

miR-124和miR-137在CD133+和CD133-人类GBM细胞中诱导有效的抗增殖和前分化作用的能力表明它们在治疗该疾病方面的潜在价值。基于RNAi的疗法对于开发全新的疾病治疗策略具有巨大的前景[45,使用sirna的早期临床试验目前正在进行中[46].由于血脑屏障的存在,将siRNAs或miRNAs输送到中枢神经系统尤其具有挑战性,但最近已经开发了一些有希望的策略来规避这一问题。这些包括经鼻输送寡核苷酸[47]、脂质包封和核酸靶向输送[48,49],以及通过对流增强输送直接给脑肿瘤组织施用治疗剂[50,51].在GBM临床前模型中进一步检测miR-124和miR-137[52,53]结合各种给药策略将有助于确定其治疗GBM的最终治疗潜力。

结论

我们已经研究了mirna在成人HGAs和hGSCs以及成人mNSCs和mOSCs中的作用。我们的研究首次表明,据作者所知,miR-124和miR-137:(1)相对于非肿瘤性脑组织,GBM肿瘤中miR-124和miR-137的表达水平显著降低;(2)在生长因子退出诱导的成年mNSCs神经元分化过程中上调;(3)促进生长因子缺失的mNSCs、mOSCs和hGSCs神经元样分化;(4)在GBM细胞和生长因子缺失的hGSCs中促进G0/G1细胞周期阻滞;(5)抑制GBM细胞中CDK6 mRNA、CDK6蛋白和磷酸化RB的表达。这些结果表明,miR-124和/或miR-137靶向递送到GBM肿瘤细胞可能对GBM疾病的治疗有治疗价值。

缩写

AA:

间变性星形细胞瘤

bFGF:

碱性成纤维细胞生长因子

光盘:

集群的区别

CDK6:

细胞周期蛋白依赖性激酶6

DMEM:

杜尔贝科改良鹰氏培养基

乙二胺四乙酸:

乙二胺四乙酸

表皮生长因子:

表皮生长因子

ES:

胚胎干

未来作战系统:

胎牛血清

FGF:

纤维母细胞生长因子

“绿带运动”:

多形性成胶质细胞瘤

GFAP:

胶质纤维酸性蛋白

HGA:

高级别星形细胞瘤

hGSC:

人类gbm来源的干细胞

MAP2:

microtubule-associated蛋白2

microrna的:

mNSC:

小鼠神经干细胞

mOSC:

小鼠少突胶质瘤肿瘤干细胞

信使rna:

信使核糖核酸

狗:

变异

nc:

神经干细胞

PDGF:

血小板源生长因子

RB:

视网膜母细胞瘤

rt - pcr:

逆转录聚合酶链反应

核:

短RNA干扰

SVZ:

subventricular区

运输安全管理局:

trichostatin一

TSC:

肿瘤干细胞

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加州大学旧金山分校

人:

世界卫生组织

WT:

野生型。

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出版前的历史

  1. 本论文的出版前历史记录可在此处访问:http://www.biomedcentral.com/1741-7015/6/14/prepub

下载参考

确认

作者要感谢UCSF综合癌症中心生物统计学核心的Jane Fridlyand和Ritu Roydas-Gupta对原发肿瘤miRNA表达数据的统计分析,以及神经外科组织库的Cynthia Cowdrey对原发人类肿瘤样本分布的统计分析。国家卫生研究院CA101777 (JGH), CA097257 (JGH), NS28478 (AAB);加州大学基因泰克发现基金(CDJ, WAW, JGH)儿童脑肿瘤基金会(CDJ, WAW, JGH);Goldhirsh基金会(艺术展);丹麦癌症协会;丹麦研究机构;国家脑瘤基金会;巴勒斯惠康基金;AANS NREF奖(DAL); Sandler Opportunity Research Award (GB, CP); AAB holds the Heather and Melanie Muss Endowed Chair; Swedish Medical Research Council and Swedish Society for Medical Research (AIP).

作者信息

从属关系

作者

相应的作者

写给J·格雷姆·霍奇森的信。

额外的信息

竞争利益

该手稿的合作者和合著者大卫·金辛格(David Ginzinger)在实验进行时是应用生物系统公司(Applied Biosystems)的一名员工。miRNA TaqMan检测由David Ginzinger提供。

作者的贡献

JS进行了miRNA表达研究、GBM细胞增殖检测、CDK6和Rb Western blotting、荧光素酶报告基因检测,制定了miRNA转染协议并帮助起草了手稿。DAL设计、实现、解释和描述了涉及SVZ-NSCs的实验。CP设计、实现、解释和描述了涉及mosc的实验。AIP设计、实现、解释和描述了涉及hGSCs的实验。AKM设计、实现、解释和描述了去甲基化和去乙酰化实验。MY协助设计、实施和解读miRNA表达研究。SRV提供了人类组织的组织病理学回顾和手稿的关键修订。DGG为miRNA表达分析提供了设计和支持。CDJ提供了整体的构思和设计支持,并对手稿进行了关键的修改。JFC为去甲基化和去乙酰化实验以及手稿的关键修改提供了设计和分析支持。 GB provided design and analyses support for the differentiation studies of mOSCs and critical revision of the manuscript. WAW provided design and analyses support for the differentiation studies of hGSCs and critical revision of the manuscript. AA–B provided design and analyses support for the miRNA expression and differentiation studies of SVZ-NSCs and critical revision of the manuscript. JGH conceived the study, participated in its design and coordination and drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Daniel A Lim, Claudia Petritsch, Anders I Persson对这项工作做出了同样的贡献。

电子辅料

附加文件1:本研究中使用的患者组织的特征。(TXT 753字节)

附加文件2:miR-124在胶质母细胞瘤多形性细胞中的表达和功能的验证。(PDF 20 KB)

12916 _2007_154_moesm3_esm.pdf

附加文件3:补充方法。此pdf文件提供了本研究中使用的方法的进一步细节。(PDF 61 KB)

12916_2007_154_MOESM4_ESM.txt

附加文件4:非肿瘤脑样本(胶质瘤)、间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中microRNA的Log2倍变化。(TXT 37 KB)

12916_2007_154_MOESM5_ESM.pdf

附加文件5:在原发肿瘤样本和神经干细胞中验证let-7a和miR-16作为适当的对照mirna。(PDF 19 KB)

12916_2007_154_MOESM6_ESM.txt

附加文件6:多形性胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤肿瘤与非肿瘤脑组织(胶质增生症)中miRNA表达的统计比较。(TXT 21 KB)

附加文件7:小鼠少突胶质干细胞中miR-124a和miR-137表达的评估。(PDF 16 KB)

12916 _2007_154_moesm8_esm.pdf

附加文件8:DNA去甲基化和去乙酰化剂处理后多形性胶质母细胞瘤细胞系中的miR表达(pd32kb)

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关于这篇文章

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西伯,J.,林,D.A.,佩特里奇,C。et al。miR-124和miR-137抑制胶质母细胞瘤多形性细胞增殖,诱导脑肿瘤干细胞分化。BMC医学6,14(2008)。https://doi.org/10.1186/1741-7015-6-14

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关键字

  • 乙二胺四乙酸
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