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肿瘤-间质界面的胶原重组有利于局部侵袭

摘要

出身背景

基质-上皮细胞的相互作用在乳腺组织中尤其重要,因为这些相互作用的失调可以促进肿瘤的发生和侵袭。此外,胶原密集的乳腺组织增加了乳腺癌的风险,尽管胶原密度与肿瘤发生之间的关系尚不清楚。由于我们对体内上皮-间质相互作用知之甚少,因此有必要观察正常上皮细胞和完整组织中的乳腺肿瘤周围的间质,以更好地了解基质组织、密度和成分如何影响肿瘤的形成和进展。

方法

采用组织学、电子显微镜和非线性光学成像方法研究了正常乳腺、乳腺肿瘤和肿瘤外植体三维培养中的上皮-基质相互作用。采用多光子激光扫描显微镜(MPLSM)对活体肿瘤组织的肿瘤-间质界面进行成像,产生内源性荧光团的多光子激发(MPE)和二次谐波产生(SHG)来成像间质胶原。

结果

我们使用激光扫描多光子显微镜和二次谐波显微镜来确定完整、未固定和未切除乳腺导管和肿瘤周围特定胶原结构的组织。胶原密度的局部改变清晰可见,使我们能够获得关于组织的三维信息乳腺间质的分化,如放射状胶原纤维,这是传统组织学技术无法获得的。此外,我们观察并定义了三种肿瘤相关胶原信号(TAC)这为定位和表征肿瘤提供了新的标记物。特别是,发现局部细胞侵袭主要是沿着某些排列的胶原纤维定向的,这表明胶原纤维相对于肿瘤的径向排列促进了侵袭。与此观察结果一致,原发性肿瘤外植体在随机培养基中培养有组织的胶原基质重新排列胶原纤维,允许单个肿瘤细胞沿着径向排列的纤维向外迁移。

结论

这些肿瘤相关胶原蛋白的呈现使我们允许我们鉴定预触及的肿瘤,并在沿径向对齐的胶原纤维侵入肿瘤 - 基质边界处的细胞。因此,TAC应该提供肿瘤的迹象,或者可以成为侵入性的,并且可以作为帮助识别和表征动物组织中乳腺肿瘤的策略的一部分。

同行评审报告

出身背景

组织微环境在维持正常细胞行为方面起着重要作用[1- - - - - -3.]此外,I型胶原是基质细胞外基质的主要成分;其表达在乳腺导管形成过程中受到时空调控,表明其在发育中起重要作用[4].与这个观点一致,降低α的水平2β1整合素,一种主要的I型胶原受体,在体外破坏乳腺上皮小管形成[2并改变体内分支形态发生[5),分别。此外,不适当的间质-上皮相互作用可促进肿瘤发生[6- - - - - -8],而在乳腺癌中,转移性上皮细胞沿间质胶原纤维直接接触而迁移[9].研究乳腺组织间基质相互作用的重要性进一步得到了证实,有胶原蛋白密集乳腺组织的患者患乳腺癌的风险增加了4倍以上[1011].虽然细胞外基质(ECM)在体内对乳腺癌发展的作用机制仍不清楚,但相关因素可能是周围富含胶原的i型基质中黏附介导的信号和机械信号传递给乳腺上皮细胞,直接或跨基膜蛋白。阐明这些信号相互作用的一个重要步骤是确定正常乳腺和完整组织中肿瘤周围胶原间质的组织结构,以便更好地了解细胞-基质相互作用以及基质的组织、密度和组成如何影响肿瘤的形成和进展。

非线性显微镜技术,如多光子激光扫描显微镜(MPLSM)和二次谐波产生(SHG),为完整组织中的细胞自身荧光和细胞外基质结构成像提供了强大的工具[12- - - - - -15].这两种技术都非常适合于高分辨率的活体成像,而二次谐波成像尤其擅长于胶原蛋白结构的成像。具体来说,多光子显微镜是由分子荧光的非线性激发产生的,可以在厚组织的深处产生图像[1617],而SHG信号依赖于可以提供亚微核分辨率的非亚苯二甲菌环境(例如Fibrillar胶原蛋白)的非线性相互作用[13- - - - - -15].最常用的多光子过程是荧光的双光子激发(2PE),其中两个低能(通常是近红外)光子同时激发一个荧光团,这个荧光团随后衰变产生一个比相应的单光子(2PE的半波长)激发能量更低的单个荧光光子[131819].在这个2PE过程中,荧光依赖于强度的平方(见方法),产生光学切片,使其在限制激发到焦点平面方面等同于共焦成像,但有助于更大的有效成像深度和更好的细胞存活率[1620].另一方面,倍频成像不是由吸收过程产生的,而是激光场在通过某些有序结构时发生非线性二阶偏振,从而产生正好为激发波长一半的相干信号[21].MPLSM和SHG可以同时在活体组织中实现,提供互补的信息和强大的实验和诊断工具,这一事实产生了巨大的效用。

本研究的目的是描述完整组织中胶原的形态特征,从而了解乳腺中上皮细胞和肿瘤间质相互作用的结构-功能关系,特别是在肿瘤进展过程中局部肿瘤细胞的侵袭。我们使用MPLSM和SHG成像,结合额外的相关显微镜技术,检测正常腺体和乳腺肿瘤附近的局部胶原密度的差异,并识别肿瘤周围不同的胶原纤维组织,具有典型的胶原结构,如与肿瘤细胞浸润相关的放射状排列的胶原纤维。识别和表征这些胶原蛋白信号有助于了解肿瘤细胞侵袭的过程,并可能为确定肿瘤侵袭潜能提供诊断能力。

方法

小鼠乳腺组织和肿瘤

这项研究得到了动物使用和护理委员会的批准,符合国家卫生研究院的动物福利指导方针。为了研究非肿瘤乳腺,我们从B6129SF2/J小鼠或Col1a1小鼠中获得组织特姆杰老鼠(杰克逊实验室,酒吧港,我,美国)。为了研究完整组织中的肿瘤 - 基质相互作用,使用了两种小鼠乳腺肿瘤模型:MMTV-WNT-1(由Caroline Alexander博士,威斯康星大学,麦迪逊,Wi,USA提供的殖民地创始人小鼠)和MMTV-多马中间 -t(杰克逊实验室标题之后的缩写Pyvt,但也常为夸张为Pymt或Pyv-mt;威斯康星大学麦田博士,麦迪逊,威斯·威斯兰,麦迪逊,Wi,USA博士提供了最初从杰克逊实验室获得的殖民地创始人小鼠。

肿瘤外植体与胶原凝胶培养

为了在体外研究肿瘤介导的胶原重组和肿瘤细胞侵袭,我们获得了肿瘤外植体,并以类似于Friedl和同事之前的报告的方式进行了培养[22].从可触及的PyVT肿瘤的中心区域(经组织学证实)用3mm的活检穿刺机捕获小块肿瘤,并在I型胶原凝胶中培养。去除后,用含青霉素/链霉素/真菌带溶液(Cellgro, Herndon, VA)的DMEM冲洗肿瘤。然后在2.0 mg/ml胶原凝胶中培养单个肿瘤(8.0 mg/ml鼠尾胶原溶液(BD Biosciences, San Jose, CA),用2 × PBS中和100 mM HEPES)。凝胶聚合1小时后,将含有胶原蛋白凝胶的肿瘤外植体从培养皿中释放出来,漂浮在含有青霉素/链霉素的DMEM溶液中,其中添加了10%的热灭活胎牛血清。在完整的三维胶原凝胶中对活(非固定)细胞进行成像。

多光子显微镜和二次谐波产生

多光子激发(MPE)利用MPLSM,可以对活体生物组织内部深处的内源性荧光团进行成像,荧光激发主要限制在焦平面内,这是由于对激光强度的二次依赖性以及多个低能光子在焦平面外被吸收的低概率[161723].对于脉冲激光激发,时间平均荧光强度是分子横截面的函数δ2λ)和激光强度的平方,t2,并可表示为[2324]:

f p t δ 2 P 大街 2 τ p f p π NA 2 hc λ 2 1 MathType@MTEF@5@5@ + = feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = vr0 = vr0dc8meaabaqaciaacaGaaeqabaqabeGadaaakeaadaaadeqaaiabbMeajnaaBaaaleaacqqGMbGzcqGGSaalcqqGWbaCaeqaaOGaeiikaGIaeeiDaqNaeiykaKcacaGLPmIaayPkJaGaeyypa0dcciGae8hTdq2aaSbaaSqaaiabikdaYaqabaGcdaWcaaqaaiabbcfaqnaaDaaaleaacqqGHbqycqqG2bGDcqqGLbqzaeaacqaIYaGmaaaakeaacqWFepaDdaWgaaWcbaGaeeiCaahabeaakiabbAgaMnaaBaaaleaacqqGWbaCaeqaaaaakmaadmaabaGae8hWda3aaSaaaeaacqGGOaakcqqGobGtcqqGbbqqcqGGPaqkdaahaaWcbeqaaiabikdaYaaaaOqaaiabbIgaOjabbogaJjab = T7aSbaaaiaawUfacaGLDbaadaahaaWcbeqaaiabikdaYaaakiaaxMaacaWLjaWaaeWaaeaacqaIXaqmaiaawIcacaGLPaaaaaa@5915@

在方程1中,δ2定义为表示双光子激发概率与光子密度平方关系的分子横截面,P是激光功率,τp为激光脉冲宽度,fp为激光重复频率,NA为数值孔径,h是普朗克的常量,c是光速,λ是波长。

与多光子激发遵循激发后能量损失的基本物理关系不同,SHG是一个遵循这种关系的守恒偏振过程[212526]:

P =χ(1)* E +χ(2)* e * e +χ(3)* e * e +…(2)

其中极化(P)和电场(E)是矢量,非线性极化率,χ(一),是张量。因此,当通过由等式2的第2术语2描述时,SHG在遭受保守的非线性,二阶偏振时患有保守的非线性,二阶偏振的激光场。

对于活的未固定的、完整的(未切片的)、未染色的腺体和胶原凝胶内的肿瘤外植体,以及苏木精和伊红染色的组织学切片的MPE和SHG成像,我们使用了光学工作站[27]这是围绕尼康日食TE300构建的。对于活体组织成像,20个乳腺组织包括9个来自Col1a1的乳腺组织特姆杰捕获Wnt-1 (n = 10,加上野生型对照)和PyVT (n = 20)小鼠的肿瘤,并将活组织保存在37℃的缓冲介质中。在组织采集后立即对所有组织进行成像,利用Ti:蓝宝石激光(spectrum - physics - millennium /Tsunami, Mountain View CA)激发源产生约100 fs脉冲宽度,调谐至890-900 nm,用于产生多光子激发(FAD细胞自身荧光)和SHG。用尼康40× Plan氟油浸透镜(N.A. = 1.4)或尼康60× Plan Apo水浸透镜(N.A. = 1.2)聚焦样品。所有的SHG成像都是从背向散射SHG信号中检测出来的[26],并通过荧光寿命成像显微镜(FLIM)证实组织中存在胶原蛋白[12,因为胶原蛋白的SHG是没有寿命的。此外,由于MPE信号和SHG信号之间的基本差异,滤波可以分离发射信号。使用464 nm(切通)长通滤波器,MPE与总发射区分,而445 nm窄带通滤波器用于分离SHG (TFI Technologies, Greenfield, MA的滤波器)。对于完整组织的三维成像,在样本的不同连续深度(z)处获取2D (x-y)图像。

使用wisscon进行采集[28是由美国威斯康星大学(University of Wisconsin, Madison, WI, USA)光学和计算仪器实验室(Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin, Madison, WI, USA)开发的软件采购包。采用ImageJ进行MPE-SHG组合图像分析[29]及VisBio [30.] 软件。使用ImageJ,通过测量从恒定阈值的密度切片之后测量胶原信号的面积来量化胶原密度的差异,并且在这些归一化区域内测量局部和平均强度。对于TACS-1图像分析,利用了ImageJ的附加表面渲染插件。对于TACS-2和-3,使用ImageJ相对于肿瘤量化胶原纤维角。定义肿瘤边界,每10微米测量相对于肿瘤边界的切线的角度。

组织学和电子显微镜

组织学方面,采用福尔马林固定石蜡包埋8只B6129SF2/J小鼠和8只Col1a1小鼠特姆杰用标准技术对小鼠进行切片和苏木精伊红、三色和小天狼星红染色。此外,所有MPLSM成像的组织随后被固定并进行组织学处理,以确认肿瘤的存在并表征肿瘤的形态。样品制备用于扫描电镜和透射电镜(SEM和TEM)的方法:将整个乳腺置于2.5%甲醛/2.5%戊二醛0.1 M卡可丁酸钠缓冲液中室温(RT)固定1小时,然后将样品置于4℃新鲜固定液中过夜。然后样品在卡可酯缓冲液中洗涤,在1.5%四氧化锇中RT后固定1.5小时。B6129小鼠标本(SEM n = 8个腺体,TEM n = 6个腺体)再次在缓冲溶液中洗涤,脱水,断裂,临界点干燥,溅膜,SEM成像,或染色,脱水清除,包埋,切片,TEM成像[31.].

结果

正常乳腺

对乳腺上皮细胞周围ECM的检查显示,大多数基质为纤维状胶原,可见上皮细胞周围(图1)1).数字1A,其中使用了picrosirius red(一种胶原选择性染色剂)表明乳腺导管结构周围存在胶原(图1 a, B)高倍扫描电镜观察显示胶原纤维以有组织的方式包裹导管结构,包围上皮细胞(图1C),以类似于图中所示的方式1A.此外,胶原蛋白可以从多个方向包裹单个细胞(图)1汉英),表明胶原蛋白作为一种包含和锚定结构的作用。更重要的是,两种扫描电镜的放大倍数更高(图1f,g)和TEM(图1H)确认胶原纤维由原纤维胶原组成(图1F;如其杆状结构和〜67nm条带状图案的存在所示[32.])与上皮细胞相邻的细胞(图1G,H).这些数据结合已发表的研究表明基质和上皮细胞之间存在重要的相互作用(见[4533.),提示这些纤维通过薄基底膜(<200 nm)施加物理约束和机械信号,或者薄网状基底膜可能包含一些小间隙或跨膜细胞过程,因此可能不能完全隔离上皮细胞;导致胶原-上皮细胞直接相互作用的微区[34.];或者,很可能是两种情况的结合。

图1
图1

乳腺中胶原形态与上皮间质相互作用.(A)小天狼星红染色(红色),选择性胶原染色,表明初级基质成分为胶原(bar = 50 μm)。(B)低放大率(柱= 10 μm)小鼠乳腺导管透射电镜图像(横切面)显示管腔外(L)上皮细胞(e)和肌上皮细胞(me)的组织,与胶原间质(s)密切相关,肌上皮细胞未将间质与上皮细胞完全分离。(C)导管末端扫描电镜图像。(D)胶原纤维与导管上皮细胞相互作用的SEM图像。(E)胶原束包裹细胞多个方向的SEM图像。(F)具有棒状结构的胶原原纤维,其特征为~ 67nm带型,证实在上皮细胞附近存在纤维胶原。(G)紧靠细胞表面的胶原原纤维的SEM图像。(H)上皮细胞旁的胶原原纤维(col)透射电镜图像(e)。

虽然组织学和电子显微镜提供了关于上皮-基质相互作用的组成和形态的有价值和详细的信息,但这些技术对样本是破坏性的,三维成像的能力是有限的。因此,我们寻求非破坏性成像技术(如MPE/SHG),允许在四个维度(x, y, z,和时间)成像。MPE-SHG联合产生清晰的胶原蛋白图像(额外的文件1)以及内源性荧光团,如NAD(H)和FAD (额外的文件1,第C部分),在完整的非治疗组织中[131521].将MPE/SHG应用于完整、未固定、未染色的乳腺,获得了图中所示的纤维基质的形态1.例如,在腺体的“上方”拍摄的图像(图2:2: g)清晰地显示了波浪状(卷曲的)胶原蛋白的存在以及紧绷(直的)原纤维束的存在(图2: a, e, f, g).拉紧的纤维显示约250 nm的周期性(图2: c),与之前关于SHG解决方案的报告一致[14],这可能代表胶原原纤维的基本~67 nm带型约有四倍的超周期性(图2: d).此外,观察到胶原蛋白包裹上皮管(与图一致)1 a, C),以及从管道向外辐射(图2: b).此外,除了检测正常乳腺的独特特征外,检测Wnt-1小鼠的上皮-基质相互作用[35.,表现为导管增生(图2 b: a - c),显示乳腺导管发育异常,胶原组织不规则(图2 b: b, c).在未固定、切片或染色的组织中清晰识别这些病理变化的能力(图2 b: d-f)验证了MPE/SHG成像的应用,可以检测正常乳腺和胶原结构,以及乳腺导管和原位胶原分布的异常(图)2 b: f).

图2
figure2

MPLSM/SHG成像显示活体乳腺中的天然胶原结构.A:(A)乳腺导管“顶部”的MPE/SHG图像,显示波浪形和紧绷(直)的胶原结构以及来自间质细胞(最可能是成纤维细胞和免疫细胞)的内源性荧光。(b)乳腺导管的MPE/SHG图像,显示胶原蛋白包裹在导管周围,并从导管向外辐射(主要可见于显微照片顶部靠近导管末端处)。(c) (a)的放大切片显示了胶原原纤维结构的某些方面,类似于结缔组织中胶原原纤维的标准条带模式。(d)小鼠肌腱的扫描电镜(SEM),小鼠肌腱显示胶原原纤维的~ 67nm带状特征。(e)胶原蛋白围绕导管上皮细胞的相关SEM图像,显示波浪形(上箭头)和紧绷(下箭头)纤维,与MPE/SHG成像获得的胶原结构相匹配。(f)乳头附近区域组织的MPE/SHG图像,显示从中央导管结构放射出的伸直的胶原纤维。(g) MPE/SHG图像“上方”乳腺导管显示波浪形和紧绷的纤维结构。注:A中所有乳腺组织均来自B6/129菌株,该菌株是col1a1小鼠的背景菌株。B:(a)野生型对照(上)和Wnt-1小鼠(下)的全量分析,与野生型相比,Wnt-1小鼠腺体增生。 (b,c) Histology of mammary glands from wild type control animals (b; H&E) and hyperplastic abnormal ducts from Wnt-1 mice (c; Masson's Trichrome). (d,e) MPLSM/SHG imaging of wild type control mammary duct demonstrating a ductal end (d) and branching (e). (f) MPLSM/SHG imaging of a mammary duct from a Wnt-1 mouse showing hyperplasia of the ductal structure and increased deposition of disorganized collagen. Note: All MPE/SHG images are from live intact tissues that are not fixed, sectioned, or stained; scale bar for MPE/SHG images equals 25 μm; scale bar for histology images equals 50 μm.

检测乳腺致密组织

高乳腺组织密度(由于胶原蛋白增加[36.)是罹患乳腺癌的单一最大风险因素之一[37.]然而,这种高风险背后的分子机制尚不清楚。这种缺陷的一个原因是缺乏足够的动物模型系统来研究体内胶原蛋白密度增加的影响。因此,我们试图确定一个动物模型系统拥有胶原蛋白密集的乳腺组织。col1a1的分析特姆杰小鼠模型(38.]揭示了这样的系统。这些小鼠在α1(i)链中具有I型胶原突变,使其耐用于人胶原酶,导致皮肤和子宫的纤维化,由于过量的胶原蛋白积累[38.]然而,这些小鼠乳腺中胶原沉积的增加以前没有被描述过。标准组织学分析清楚地显示,无论是纯合子还是杂合子雌性小鼠,无论处于何种假性状态,乳腺导管周围的胶原都增加了(图1)3Avs3C额外的文件2).利用组织病理学和成像技术,采用MPLSM对切片进行苏木精-伊红染色(福尔马林固定后SHG信号不存在;数据未显示),证实胶原蛋白增加(图3B.vs3d),以及Col1a1小鼠明显的增生(图3 c, D额外的文件2).有趣的是,这种增生与浸润性上皮细胞有关,这些上皮细胞类似于导管末端的上皮-间质转化(图)3 c, D).因此,与Jain和同事们所采取的方法相反[39.如果用SHG检测到体内体内胶原蛋白的降低,我们检测到活性完整乳腺中的胶原蛋白增加。从COL1A1杂合和纯合鼠的腺体分析,以及相关的野生型凋落物,显着揭示了转基因小鼠周围上皮管道的胶原蛋白增加(图3情况),展示了我们检测胶原密度差异的能力。此外,胶原蛋白是局部密集的邻近上皮(包裹),以及增加的空间扩展管导致2.53 - 2.79(±0.24)和(0.34±)(平均±SEM)褶皱的面积在不断增加胶原蛋白的信号,以及增加信号强度在管,杂合的和纯合子col1a1特姆杰分别与野生型动物相关的小鼠。因此,col1a1小鼠模型似乎是研究胶原密度增加对正常和转化上皮细胞的影响的一个有希望的候选对象,因为适当杂交的杂合col1a1小鼠能够形成肿瘤,而不受胶原酶抗性基质的抑制(p.p.p和P.J.K未发表的观察结果)。此外,我们可以识别密度的变化,并从完整乳腺组织内部的深度(最大深度:440nm)获得图像(图)3h.额外的文件4),无需对组织进行固定、切片或染色,这表明该方法可以在活体动物或组织模型中广泛应用,以了解与病理条件相关的基质变化。

图3.
图3

MPLSM/SHG成像检测乳腺中胶原密度增加.(A)亮场显微镜下野生型对照乳腺H&E染色。(B) (A)的MPE图像显示MPLSM能显示胶原结构。(C) col1a1/col1a1纯合子小鼠乳腺的H&E染色。(D) (C) MPE图像显示胶原密度和结构增加,上皮-间质边界不规则,上皮细胞侵入局部增加的胶原间质。(E-G)野生型(E)、杂合子(F)和纯合子(G) col1a1小鼠活体乳腺导管未固定、切片或染色的MPLSM/SHG图像,显示转基因动物中胶原密度增加。(H) (F)跨越340 μm(典型深度能力350-440 μm)的z -堆栈,说明了腺体的结构和它们在腺体中的相对位置(见图)额外的文件4)注:MPE/SHG图像的比例尺等于25μm。

肿瘤相关胶原信号(TACS)

胶原蛋白与肿瘤有关signature-1

Wnt-1小鼠的肿瘤进展包括增生、乳腺腺癌和浸润性(转移性)导管癌,分析显示多个上皮细胞簇,包含出血性区域,混杂并被增加的胶原间质(即纤维组织增生)包围,与之前的报道一致[35.]重要的是,胶原蛋白的增加使我们能够识别可触及的肿瘤(图4:得了额外的文件5;并通过组织学证实(数据未显示),我们将其归类为三种肿瘤相关胶原信号(TAC)之一。即TACS-1:致密胶原的存在(图4:),以信号强度增加表示(见图中的地形图)4A)在肿瘤附近区域(图4:额外的文件5)作为定位小肿瘤区域的可靠标志。虽然在肿瘤附近有胶原蛋白增加的报道,但这种胶原蛋白的结构以前大部分是未知的,如图所示的额外的局部定位4A表明肿瘤周围胶原蛋白浓度升高,局部高密度区域增加。然而,目前尚不清楚:(1)存在促进肿瘤形成的肿瘤前致密区,(2)胶原致密区通过上皮肿瘤团块或肿瘤边界运动细胞的收缩增加而被拉成一组簇,或(3)成纤维细胞活化导致局部胶原沉积增加。对这一基本特征的进一步分析将为肿瘤的发生和发展提供有用的信息。

图4.
装具

肿瘤-间质相互作用:三种TACS在Wnt-1小鼠肿瘤中的表现.(A-C)经鉴定的TACS显微照片。TACS-1。TACS-1的MPE/SHG图像。即一个密集的胶原蛋白区域(a和表面图)“以上”为不可触及的肿瘤(b,c;黄色轮廓),提示有小肿瘤(也见图)额外的文件5).表面图量化了荧光信号相对于x-y位置的强度,清楚地显示胶原蛋白信号增加,并代表6个Wnt-1肿瘤和8个PyVT肿瘤(未显示)B: TACS-2。第二次TACS的MPE/SHG图像显示纤维变直(绷紧),为较大Wnt-1肿瘤的特征。B: a-c, Wnt-1小鼠胶原纤维的MPE/SHG图像围绕相对光滑的肿瘤边界延伸(c中有一条黄线),这表明大多数纤维平行于肿瘤边界。B:直方图,测量了6个独立肿瘤中86个区域的胶原纤维相对于肿瘤边界切线的角度,并用频率分布表示,纤维分布在0°左右。C: TACS-3。第三种TACS: Wnt-1小鼠细胞侵袭区对齐的胶原纤维。C: a- C, a用黄色标出与局部浸润相关的不规则肿瘤边界,并与主要沿肿瘤初始边界正常分布的纤维相连,以相对于肿瘤边界约90°的频率分布表示。C:直方图,测量6个独立肿瘤中71个区域的胶原纤维相对于肿瘤边界切线的角度,并用频率分布表示,纤维分布接近90°。比例尺为25 μm。

肿瘤相关的胶原蛋白标记2和3

随着肿瘤体积的增大,我们发现了第二个胶原特征,TACS-2:“紧绷”的胶原纤维围绕着肿瘤(图)4B.).基质的胶原形态可能源自拉伸由于肿瘤生长,这可能采取行动限制的部分肿瘤(即压缩克制)以及在扩大提供一段引起的拉应力纤维(和更大的抗细胞基质收缩),以此来刺激和激活成纤维细胞。Wnt-t小鼠肿瘤抑制的证据如图所示4 b, a - c,纤维角主要沿肿瘤边界切向分布(相对于肿瘤边界0°),胶原纤维沿肿瘤边界拉伸相对光滑(见图直方图)4B.).

在正在生长和侵袭的肿瘤肿块区域(图4C:a-c),第三个与肿瘤相关的胶原标记,TACS-3,被识别出来:胶原纤维正常排列到肿瘤边界区域,显示不规则形状——表明通过聚集的上皮细胞迁移局部侵袭[2240].浸润性肿瘤形态见于胶原纤维主要沿细胞浸润方向排列的肿瘤区域(见图中的直方图)4C其中,胶原纤维与肿瘤边界的夹角分布在90°左右)。此外,在TACS-3被注意到的区域,我们观察到一组细胞以集体方式从肿瘤边界前进,似乎正在集体侵袭[224041.],以及可能与单细胞迁移有关的个体入侵细胞,类似于在体内异种移植模型中沿胶原纤维所观察到的[9].

为了进一步研究第三种胶原标记在侵袭性和转移性更强的癌症模型中的行为,我们使用了建立良好并具有特征的PyVT小鼠模型。该模型与人类癌症的许多方面相似,在定义、进行性和可靠的组织学分级后,从增生到腺瘤,然后到早期和晚期癌,具有可靠的侵袭性和转移性,因此为研究人类疾病提供了一个良好的模型[42.].该模型中的肿瘤细胞行为和胶原形态与Wnt-1小鼠肿瘤的观察结果相似。例如,追踪单个肿瘤周围的肿瘤-间质边界(图5A-D)首先揭示了TACS-2形态的区域,其中抑制胶原蛋白包裹在一个相对光滑的边界周围(图5 a、B,直方图:TACS-2)。在TACS-2的区域中,细胞大多是随机对齐与与胶原相同方向上的细胞子集(图5 a、B).第二区域显示TACS-3边界,胶原主要垂直于肿瘤(图)5C,D柱状图:TACS-3)。这种行为的合理假设是,胶原纤维重组是通过肿瘤边界细胞的形态发生和收缩事件发生的,以组织基质并为局部侵袭做准备(见图)6对于TACS-2到-3过渡)。这一假设的证据可以从Wnt-1肿瘤中与侵袭细胞区域相关的胶原结构中看出来(图)4C),PyVT肿瘤(图5A-D;数字6),肿瘤组织切片浸润区MPLSM分析(额外的文件3).在所有这些病例中,局部肿瘤浸润发生在胶原纤维从肿瘤向肿瘤细胞浸润方向呈放射状排列的地方(见图中TACS-3直方图)5,基质排列的变化与图中浸润细胞形态的变化相关6).此外,一些入侵细胞与纤维直接接触(图)5 e, F;数字6 c, D).在某些情况下,一些矩阵无序也可以观察到(见图)4 c: c和图5 e)可能表明胶原蛋白的蛋白裂解[4043.].

图5.
figure5

TACS-2和-3在更具侵袭性PyVT小鼠肿瘤模型中的研究. (A) TACS-2,在更高的亮度和对比度水平下显示扩大的切除区域(B),并粗略划分肿瘤间质边界(红线;s=间质;t=肿瘤),进一步指示平行于肿瘤边界的胶原包裹(分布在0°附近,见右上角8个独立肿瘤106个区域的TACS-2直方图)。(C)TACS-3,在较高亮度和对比度水平下显示放大的切除区域(D)以及肿瘤-基质边界的粗略划分(红线;s=基质;t=肿瘤)。注意,尽管一些细胞已经移过该边界(示例=x)在纤维中,边界作为向径向排列的胶原纤维的不规则浸润区域的一般表示(频率分布约90°,见右中TACS-3直方图,其中有8个独立肿瘤的109个区域)。此外,在更高放大率(F)下分析TACS-3区域(E)显示肿瘤间质边界和肿瘤内与纤维相关的内源性细胞。*表示与侵袭性肿瘤边界交叉的纤维和与侵袭性肿瘤细胞接触的纤维示例(红色箭头)。MPE/SHG图像A、C、E和F的比例尺为25μm,B和D的比例尺为10μm。

图6.
figure6

tcs -3:与侵袭相关的放射状排列的胶原纤维.结合MPE/SHG成像,活的完整PyVT乳腺肿瘤表明(A)非侵袭区域(*)具有紧致胶原蛋白(TACS-2;白色箭头)被包裹在肿瘤周围,而侵袭区域(x)与对齐的胶原蛋白相连,细胞沿着放射状对齐的胶原纤维(TACS-3;黑色箭头)。在高倍镜下(B和C)对肿瘤-基质界面的侵袭检查清楚地显示了特定侵袭区域的胶原排列(B)与肿瘤细胞(*)之间,并与,(D)单个肿瘤细胞附着在远离原发肿瘤的胶原纤维上的例子。此外,通过分离MPE和SHG信号或使用FLIM成像,可以看到已经越过肿瘤-基质边界的肿瘤细胞。(E)便于局部入侵的TACS-3区域的MPE/SHG组合图像。肿瘤-间质边界在这个阶段没有很好地保存,但粗略地用红色勾勒出来。已侵入边界的细胞区域用星号标记(t =原发肿瘤)。 The red arrowhead indicates cells near the tumor boundary that are migrating along aligned collagen fibers away from the primary tumor. (F) MPE and SHG signal separation of the image shown in E. MPE signal is represented in red pseudo-color while SHG is shown in green pseudo-color. Note the interdigitation of aligned collagen fibers (green) into the tumor, with individual, or lines of, cells (* in E) migrating away from the tumor on collagen fibers. (G) FLIM micrograph of invading cells at the TACS-3 region shown in E and F. Collagen (blue; no fluorescence lifetime) can be distinguished from cells (green to yellow), confirming the presence of invading cells at the tumor-stromal boundary and cells that have migrated past the boundary in association with collagen. The color bar in G ranges represents the weighted mean ranging from 100 ps (blue) to 1 ns (red). Scale bars equal 25 μm in A, E, F, and G; 10 μm in B, C, and D.

为了进一步验证肿瘤细胞重组胶原基质以促进局部侵袭的假设,我们确定肿瘤细胞是否可以重组随机胶原基质。对I型胶原凝胶内肿瘤外植体的分析显示,肿瘤细胞侵入先前随机排列的胶原凝胶区域的胶原呈放射状排列(图7),与以往分析三维重建基质中固定肿瘤外植体的报道一致[22],以及关于完整活组织内浸润的支持信息(图456).聚合后,圆形胶原凝胶(圆盘)显示胶原纤维的随机方向(图)7一个)在没有外力启动结构重组的情况下,在这种随机胶原凝胶中培养的肿瘤外植体收缩并重组这些胶原凝胶,导致各种局部结果,胶原在非侵袭区域包裹在外植体周围(图1)7 b).相反,在侵入凝胶的区域,胶原被重组成放射状排列(图7 c),胶原纤维与侵入细胞直接接触(图7 c, D)这表明肿瘤细胞可以从头重组随机胶原基质以促进侵袭,支持肿瘤界面处的基质重组促进体内局部侵袭的假设。因此,我们的结果表明,为了促进局部侵袭,肿瘤边界处的细胞收缩并对齐胶原fibers,可能是在蛋白水解切割的帮助下促进基质重组,然后沿着排列的胶原结构侵入以扩大肿瘤并随后转移。

图7.
figure7

肿瘤细胞重组胶原基质有利于肿瘤细胞的局部侵袭.在3D胶原凝胶中培养的肿瘤外植体的组合MPE / SHG成像八小时培养8小时,表明肿瘤细胞重新组织了先前随机基质以促进侵袭。(a)从肿瘤远离肿瘤的3D胶原凝胶的区域证明了在没有通过特定外力重新组织的区域中存在的3D胶原凝胶中存在的胶原蛋白的随机取向。这种随机组织被肿瘤外植体的细胞特异性改变,因为细胞合同并重新组织胶原基质。类似于Live Intact组织中的数据,非入侵区显示胶原蛋白在近似植体附近拉,但缠绕在肿瘤边界(B)周围,而在肿瘤细胞侵袭到胶原凝胶中,胶原蛋白已被肿瘤细胞径向对齐(白色箭头C)与细胞(*)直接接触胶原矩阵(白色箭头; D)。因此,在肿瘤细胞侵袭的区域,胶原蛋白已重新组织以与随机取向的径向对齐,表明胶原纤维的结构重新探讨促进局部侵袭。秤杆等于25μm。

讨论

多光子激发的固有荧光检测结合SHG有助于在未固定、未切除、未染色的乳腺组织中进行三维、高分辨率成像。这种成像提供了通常通过经典组织学和EM获得的信息,无需复杂和破坏性的样品制备,并且h四个维度的额外结构信息。MPE/SHG可以在440 nm的深度清晰地成像乳腺组织,并且可以可靠地检测到胶原密度的变化。此外,原位肿瘤的三维成像显示了三个现在定义的TAC,它们为定位和表征tum提供了标准标志ors:TACS-1,致密胶原的存在,表现为肿瘤周围区域的信号强度增加,作为定位小肿瘤区域的标准标志;TACS-2,拉紧(拉直)的存在胶原纤维在肿瘤周围伸展,表明生长导致肿瘤体积增加;TACS-3,识别促进侵袭的放射状排列的胶原纤维,这可能表明肿瘤的侵袭和转移生长潜力。这些特征结合在一起可能有助于识别和表征肿瘤在实验动物模型以及人类癌症和新鲜肿瘤活组织检查中,对乳腺肿瘤进行再灌注。

乳腺上皮细胞- ecm相互作用影响细胞极性、增殖、分化、粘附和迁移[44.45.而I型胶原蛋白是发育过程中乳腺导管形成的重要调节因子[4].对正常乳腺的分析显示,胶原纤维缠绕在导管周围,同时也向外辐射(图)2: b).多光子显微镜分析发现,在发育中的乳腺固定的整个组织中,胶原纤维垂直于末端芽被“拉入”[46.,类似于我们在肿瘤附近观察到的放射状排列的胶原纤维(TACS-3)。综上所示,这些形态学为乳腺的结构-功能关系提供了线索,并暗示胶原蛋白可能在发育过程中提供方向性线索,也影响正常乳腺的变化。例如,卷曲(波状)的胶原蛋白结构(即图2A:a、b、e、g)与结缔组织中卷曲的胶原纤维的大量报道一致,这种纤维允许正常组织变形,具有应变硬化行为[47.48.].这种行为也适用于乳腺,允许组织变形、正常导管生长和退化,而不会过度约束系统,同时为收缩细胞提供足够水平的抗张性,并抵抗可能损坏组织的大变形。数量较少的拉紧纤维可能有不同的用途。它们可能在单细胞水平上起局部约束结构的作用,并可能将组织中的各种导管连接在一起并连接到乳头结构(图1)2: f),在哺乳等活动中,可能会将机械信号传递到导管,从而引发与泌乳有关的机械传导信号。此外,这种直接作用于上皮细胞或通过基底膜传递应力的机械信号会因乳腺组织密度的增加而放大。因此,体内乳腺组织密度的增加可能通过致密组织中机械信号事件的增加促进癌的形成,这与体外研究表明基质密度的增加改变乳腺上皮细胞信号一致[49.].

研究表明,调控不当的基质-上皮相互作用可以促进肿瘤发生,这说明了乳腺上皮周围基质组成和形态的重要性[6- - - - - -8]而乳腺癌常剧表现出脱蛋白(围绕侵袭性肿瘤的过量胶原蛋白[50])此外,癌细胞可以局部侵入基底膜和胶原基质,扩散到邻近的ECM环境中,在那里它们可以进一步迁移进入淋巴管和血管,导致远处组织的转移性生长[4051].因此,了解体内的入侵机制具有重要意义。然而,据我们所知,没有研究显示在体内内源性肿瘤的局部侵袭与间质组织有关。因此,值得注意的是,我们观察到了活组织局部侵袭区域(TACS-3)胶原纤维的排列,以及单个细胞与这些纤维的关联,这与异种移植模型中单个细胞沿着胶原纤维迁移的观察相似[9,并证实和扩展了3D基质的体外研究,这些研究已经确定了入侵细胞前沿的胶原重组(排列)[224041.].此外,排列促进侵袭的概念似乎在集体细胞迁移中具有重要意义(例如,乳腺的小管形成;[41.]),因为在侵犯乳腺导管树时,在末端芽处可见胶原排列[46.].因此,在正常发育过程中,胶原蛋白排列可能促进运动和迁移,而肿瘤侵袭可能类似于失调的发育过程。

结论

目前的数据表明,肿瘤细胞通常定位于致密的胶原蛋白附近,或促进结缔组织增生反应并收缩和定位胶原蛋白,随后肿瘤生长和胶原蛋白基质的扩张(拉伸)导致基质重组(可能借助于蛋白水解裂解[4043.]释放胶原蛋白纤维),帮助促进局部侵袭。这种基质重组需要增强肿瘤细胞的收缩性和运动性,这可以解释浸润性癌症中Rho和ROCK的增加([52],以及其中的参考文献)。虽然许多机制,如生长因子和整合素信号转导以及蛋白酶的分泌和活性,都与侵袭和转移有关,但似乎gtpase调控的运动事件也参与了这些过程。因此,局部侵袭背后的机制可能包括通过gtpase介导的肿瘤细胞收缩性的基质重组(p.p.p和P.J.K未发表的观察结果),导致排列一致的基质促进局部侵袭。

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出版前的历史

  1. 本文出版前的历史可在此浏览:http://www.biomedcentral.com/1741-7015/4/38/prepub

下载参考

致谢

作者感谢Caroline Alexander博士和Amy Moser博士提供了colony创始人小鼠,Curtis Rueden为VisBio提供了帮助,材料科学中心和BBPIC为EM资源提供了帮助。这项工作得到了DOD-CDMRP/BCRP:W81XWH-04-1-0428对PPP的资助,S.G.Komen基金会:BCTR02-1841和NIH:CA076537对P.J.K.和N的资助IH NIBIB:R01-EB000184至J.G.W和K.W.E。

作者信息

从属关系

作者

相应的作者

给保罗·P·普罗文扎诺或帕特里夏·J·基利的信件。

额外的信息

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。然而,手稿中提出的部分技术正在申请专利。作者没有兴趣,安排,或从属关系,可能被认为是利益冲突的背景下,本手稿。

作者的贡献

PPP进行了所有的MPLSM、SHG、SEM和组织学实验,管理小鼠菌落,进行3D细胞培养实验,分析成像数据,制作手稿和图形。DRI辅助小鼠进行3D培养实验。JMC对小鼠腺体进行TEM成像。KWE和JGW在非线性成像和数据分析的具体技术方面以及项目协调方面提供协助。PJK参与了项目的设计和协调,并协助进行数据分析。PPP、KWE、JGW和PJK合作设计了该项目,并讨论了数据解释和分析。所有作者都参与了手稿的批判性编辑,并阅读并批准了最终的手稿。

电子补充资料

(A)

附加文件1:结缔组织中胶原和内源性荧光的MPM/SHG成像以及重建的3D基质。小鼠跟腱中I型胶原的SHG图像。(b)皮肤内源性细胞荧光和胶原蛋白的MPM/SHG图像。(C)小鼠胸肌MPM/SHG联合成像检测胶原和NADP(H)。(d)重组三维凝胶中I型胶原的SHG成像…(PDF 9 MB)

(A)

Col1a1tmJae小鼠具有胶原致密的乳腺组织。纯合子col1a1小鼠组织学显示乳腺导管周围胶原蛋白增加,用H&E三色染色和小天狼星红(Picro)染色检测。(b)在H&E检测的杂合子col1a1小鼠中,胶原蛋白也增加;小天狼星红染色(PS)。(PDF 9 MB)

12916_2006_101_moesm3_esm.pdf.

附加文件3:PyVT肿瘤H&E切片中TACS-2和TACS-3的MPLSM检查。左栏:肿瘤的非侵入区域显示TACS-2(见左中面板箭头),可通过MPLSM确认(左下)。右栏:肿瘤的侵入区域显示TACS-3(见右中面板箭头,了解侵入细胞的示例)可以用MPLSM(Buton右)进行检测和确认。顶行中的框表示中间板检查的区域。(PDF 9 MB)

12916_2006_101_moesm4_esm.avi.

附加文件4:电影文件显示,在>440µm处,胶原蛋白围绕乳腺导管进入活组织。(AVI 9 MB)

附加文件5:显示TACS-1 MPE/SHG成像的影片。(AVI 4 MB)

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普罗文扎诺,P.P., Eliceiri, K.W., Campbell, J.M.et al。肿瘤-间质界面的胶原重组有利于局部侵袭。BMC医学4,38(2006)。https://doi.org/10.1186/1741-7015-4-38

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  • 乳腺
  • 胶原纤维
  • 二次谐波发生
  • 正常的乳腺
  • 肿瘤边界
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